Endtransferase-vermittelte dUTP-Nick-Endmarkierung – TUNEL-Assay: Eine In-situ-Methode zum Nachweis der DNA-Fragmentierung in apoptotischen Zellen

Mit mikrobiellen Krankheitserregern infizierte Wirtszellen durchlaufen die Apoptose - den programmierten Zelltod. Während der Apoptose bauen DNasen die chromosomale DNA in kleine Fragmente ab, was zum Zelltod führt.

Um Apoptose mit dem TUNEL-Assay nachzuweisen, nehmen Sie einen Objektträger mit einem deparaffinisierten und rehydrierten Hautgewebeschnitt, der mit einem Pilzerreger infiziert ist.

Behandeln Sie das Gewebe mit Proteinase-K, um die zellulären DNasen zu inaktivieren und zu verhindern, dass sie die DNA während der Analyse möglicherweise abbauen. Fügen Sie Wasserstoffperoxid hinzu, um die Reaktion zu löschen, und waschen Sie den Objektträger, um nicht umgesetzte Proteinase-K zu entfernen.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der Digoxigenin-markierte Desoxyuridintriphosphate oder dUTPs enthält. Ergänzen Sie es mit einer terminalen Desoxynukleotidyltransferase, einem TdT-Enzym und inkubieren Sie. In apoptotischen Zellen katalysiert das TdT-Enzym die Bindung von markierten dUTPs an die exponierten 3'-Hydroxylgruppen der fragmentierten DNA.

Fügen Sie als Nächstes einen Anti-Digoxigenin-Antikörper hinzu, der an einen Rhodamin-Reporter konjugiert ist, und inkubieren Sie ihn im Dunkeln, um die Antikörperbindung an Digoxigenin-markierte dUTPs zu erleichtern und bei der Bildgebung eine rote Fluoreszenz zu erzeugen.

Behandeln Sie die Gewebeproben mit einer fluoreszierenden Kerngegenfärbung, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Legen Sie ein Deckglas über den Gewebeschnitt und visualisieren Sie ihn unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Die blaue Fluoreszenz hilft bei der Identifizierung der Zellkerne aller Zellen im Gewebeschnitt, während das Vorhandensein von roter Fluoreszenz in den mit Rhodamin gefärbten Zellen auf eine DNA-Fragmentierung aufgrund der Apoptose hinweist.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie hydrophile Glasobjektträger mit Probengewebe vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die Gewebeschnitte zu entparaffinisieren, waschen Sie die Objektträger dreimal mit Xylol, jeweils 5 Minuten lang, in einem Coplin-Glas. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal für jeweils 5 Minuten mit 100% Ethanol. Waschen Sie danach die Objektträger jeweils 3 Minuten lang mit 95 % Ethanol und 70 % Ethanol und waschen Sie die Objektträger dann einmal 5 Minuten lang mit PBS.

Zur Herstellung von experimentellen und negativen Kontrollobjektträgern behandeln Sie das Gewebe vor, indem Sie frisch verdünnte Proteinase K direkt auf die Objektträger geben. Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dann zweimal für jeweils 2 Minuten in PBS.

Um Positivkontrollobjektträger herzustellen, behandeln Sie das Gewebe mit DN-Puffer vor und inkubieren Sie die Objektträger dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Danach wird die in DN-Puffer gelöste DNase I auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter gebracht. Geben Sie die vorbereitete DNA-Lösung zu den Objektträgern. Inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie dann die Seiten fünfmal jeweils 3 Minuten lang mit destilliertem Wasser in einem Coplin-Glas.

Die Reaktion in 3%igem Wasserstoffperoxid in PBS 5 Minuten bei Raumtemperatur abschrecken. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal für jeweils zwei Minuten in PBS. Fügen Sie dann dem Gewebe auf den Objektträgern Gleichgewichtspuffer hinzu. Inkubieren Sie 10 Sekunden lang bei Raumtemperatur und klopfen Sie dann die überschüssige Flüssigkeit um den Gewebeabschnitt herum ab.

Verdünnen Sie das terminale Desoxynukleotidyltransferase-Enzym in Reaktionspuffer und fügen Sie es dann dem Gewebe auf den experimentellen und positiven Kontrollobjektträgern hinzu. In einer befeuchteten Kammer 1 Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Legen Sie danach die Objektträger in ein Coplin-Gefäß, in dem sich die Arbeitskonzentration des Stopppuffers befindet. 15 Sekunden lang rühren und dann die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dann die Objektträger dreimal jeweils 1 Minute lang mit PBS und klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.

Geben Sie anschließend das auf Raumtemperatur vorgewärmte Anti-Digoxigenin-Konjugat direkt auf das Gewebe. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten dunklen Kammer.

Waschen Sie die Objektträger nach Abschluss der Inkubation viermal jeweils zwei Minuten lang mit PBS. Klopfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab. Fügen Sie dann an den Seiten Eindeckmedium hinzu. Geben Sie 15 Mikroliter DAPI-Lösung in das Eindeckmedium auf den Objektträgern. Decken Sie jede Folie mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Lassen Sie die Dias im Dunkeln trocknen.

Betrachten Sie die Objektträger unmittelbar nach Abschluss des Färbevorgangs mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Nehmen Sie 400 Mal in zufälligen Abständen Fotos entlang jedes Hautabschnitts auf. Zählen Sie DAPI-gefärbte blaue Blutkörperchen, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Zellen pro Hautschnitt und Tier sichtbar sind. Zählen Sie als nächstes die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen, die als rote Einzelzellen mit klaren Zellrändern erscheinen.