JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 2:54 Min. • July 8th, 2025
Caspase-3 und Caspase-7 sind Proteasen, die die DEDD-Tetrapeptidsequenz in Zielproteinen erkennen und sie am C-Terminus des Asparaginsäurerests spalten. Diese spielen eine herausragende Rolle bei der Apoptose-Kaskade – dem programmierten Zelltod.
Um die Caspase-3/7-Aktivität in apoptotischen Zellen zu beurteilen, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit einem Explantat aus Froschzehenhaut, das mit Apoptose-induzierenden Pilzen infiziert ist. Geben Sie einen geeigneten Puffer und ein paar Metallperlen in die Tube.
Verwenden Sie Bead-Beating, um die Hautzellen aufzubrechen und zelluläre Inhalte, einschließlich Caspase-3/7-Proteine, freizusetzen. Zentrifugieren Sie das Rohr, die Zellreste und die Organellen. Aspirieren Sie den proteinreichen Überstand aus dem Röhrchen und pipettieren Sie ihn in die Vertiefungen einer Multiwell-Assay-Platte.
Ergänzen Sie die Vertiefungen mit dem luminogenen Caspase-Reagenz. Dieses Reagenz besteht aus einem prolumineszierenden Substrat, das das DEVID-Peptid in einer gepufferten Lösung enthält, die ATP, Magnesiumionen und das Luciferase-Enzym enthält.
Den Inhalt der Vertiefung mischen und inkubieren. Während der Inkubation spaltet Caspase-3/7 das prolumineszi
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