Der Phagozytose-Assay: eine Immunfärbetechnik zur Visualisierung des apoptotischen Zellengulfments in den embryonalen Zellen von Drosophila melanogaster
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 4:48 Min. • July 8th, 2025
Makrophagen sind spezialisierte Immunzellen, die die Zellen durch Apoptose - den programmierten Zelltod durch Phagozytose - reinigen.
Um die apoptotische Zellverschlingung zu beurteilen, beginnen Sie mit einem Objektträger mit fixierten embryonalen Drosophila-Zellen, einschließlich apoptotischer Körper, die von Hämozyten - wirbellosen Makrophagen - verschlungen werden.
Behandeln Sie die Zellen zunächst mit einem blockierenden Reagenz, das die unspezifischen Stellen blockiert. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die an die Croquemort-Rezeptoren binden - phagozytische Marker von Hämozyten. Waschen Sie die überschüssigen Antikörper ab.
Fügen Sie alkalische Phosphatase-markierte Sekundärantikörper hinzu, die an die Primärantikörper binden. Geben Sie nun eine geeignete chromogene Substratlösung auf den Objektträger und inkubieren Sie. Während der Inkubation reagiert die alkalische Phosphatase mit dem chromogenen Substrat und bildet violett gefärbte Granulate in den Hämozyten.
Als nächstes fügen Sie ein Reaktionsgemisch hinzu, das die terminale Desoxynukleotidyltransferase, das TdT-Enzym und Digoxigenin-gebundene Nukleotide umfasst. TdT katalysiert die Bindung von Digoxigenin-gebundenen Nukleotiden an die exponierten 3'-OH-Enden der fragmentierten DNA in den apoptotischen Körpern.
Fügen Sie als nächstes Anti-Digoxigenin-Antikörper hinzu, die an den Peroxidase-Reporter konjugiert sind und an die Nukleotide an der Stelle der DNA-Schädigung binden. Behandeln Sie die Zellen mit einer Peroxidase-spezifischen chromogenen Substratlösung und inkubieren Sie. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation des Substrats, erzeugt farbige Ausfällungen und färbt die apoptotischen Körper braun.
Zum Schluss visualisieren Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop. Das gleichzeitige Vorhandensein von violetten Körnchen und braunen Signalen aus den Zellen deutet auf Hämozyten hin, die phagozytierte apoptotische Körper enthalten.
Um die Zellen mit Anti-Croquemort-Antikörpern zu immunfärben, wird der Objektträger zunächst seriell in Methanol eingeweicht, dann wird PBS mit 0,2 % Triton X-100 ergänzt, gefolgt von PBS allein. Als nächstes wird die unspezifische Bindung mit 20 Mikrolitern 5 % Vollkornserum in PBS + 0,2 % Triton X-100 für 20 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Entfernen Sie die überschüssige Blockierungslösung und markieren Sie die Zellen über Nacht mit 20 Mikrolitern Anti-Croquemort-Antiserum bei 4 Grad Celsius.
Waschen Sie den Objektträger am nächsten Morgen in PBS + Triton X-100 für fünf 10-minütige Inkubationen. Spülen Sie den Objektträger nach dem letzten Waschen 10 Minuten lang in PBS aus. Markieren Sie dann die Zellen 1 Stunde lang mit 20 Mikrolitern alkalischer Phosphatase-markiertem Anti-Ratten-IgG bei Raumtemperatur.
Waschen Sie den Objektträger am Ende der Inkubation fünfmal in PBS + Triton X-100, wie gezeigt, gefolgt von einem 10-minütigen Einweichen in Pufferlösung. Markieren Sie dann die Zellen mit Phosphatase-Substratlösung und beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop.
Wenn starke violette Signale im Hämozytengranulat auftreten, entfernen Sie das überschüssige Substrat und weichen Sie den Objektträger 5 bis 10 Minuten lang in Puffer ein, der mit EDTA ergänzt ist. Spülen Sie die Zellen am Ende der Inkubation mit zwei 5-minütigen PBS-Waschungen und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit Äquilibrierungspuffer
.Nachdem Sie die Lösung entfernt haben, markieren Sie die Zellen 1 Stunde lang mit 20 Mikrolitern terminaler Desoxynukleotidyltransferaselösung bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie dann die Lösung aus dem Objektträger und weichen Sie die Zellen 10 Minuten lang in 0,5 Millilitern Stoppwaschpuffer in 17 Millilitern Wasser ein. Spülen Sie anschließend die Zellen mit drei 5-minütigen PBS-Waschungen und markieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 20 Mikrolitern Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen viermal in PBS, wie gezeigt, und weichen Sie den Objektträger in 30-Sekunden-Schritten in Peroxidasesubstrat ein, bis die apoptotischen Zellen braun werden. Wenn eine optimale Färbung erreicht wurde, weichen Sie den Objektträger in Wasser ein, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Beurteilung der Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen unter Verwendung von Drosophila-Embryonalzellen beschrieben. Das Verfahren umfasst Immunfärbetechniken, um die Phagozytose apoptotischer Körper durch Hämocyten sichtbar zu machen.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Phagozyten spielen eine entscheidende Rolle beim Abbau apoptotischer Zellen.
- Drosophila dient als Modellorganismus zur Untersuchung von Immunantworten.
- Phagozytose ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase.
- Mittels Immunfärbung lassen sich spezifische zelluläre Prozesse sichtbar machen.
Zweck der Studie
- Die Methodik zur Beurteilung der Aufnahme apoptotischer Zellen demonstrieren.
- Die Interaktion zwischen Hämocyten und apoptotischen Körpern sichtbar machen.
- Forschern auf dem Gebiet eine detaillierte Anleitung bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Verwendung fixierter Drosophila-Embryonalzellen auf Objektträgern.
- Blockierung nicht-spezifischer Bindungsstellen mit Serum.
- Anwendung von primären und sekundären Antikörpern für die Immunfärbung.
- Sichtbarmachung der Zellen unter dem Lichtmikroskop nach chromogenen Reaktionen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von Hämozyten, die phagozytierte apoptotische Körper enthalten.
- Beobachtung einer unterschiedlichen violetten und braunen Färbung, die auf verschiedene zelluläre Bestandteile hinweist.
- Nachweis effektiver Immunfärbungstechniken zur Visualisierung der Apoptose.
- Verfeinerung des Protokolls zur Verbesserung der Ergebnisklarheit.
Schlussfolgerungen
- Die Methode veranschaulicht wirksam die Rolle von Makrophagen beim Abbau apoptotischer Zellen.
- Die Immunfärbung liefert wertvolle Einblicke in zelluläre Wechselwirkungen während der Apoptose.
- Dieses Protokoll kann von Forschern genutzt werden, um ähnliche Prozesse in anderen Modellen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Immunfärbungstechnik ermöglicht die Visualisierung des Abbaus apoptotischer Zellen durch phagozytierende Zellen und unterstützt die Zielvalidierung in der Immunologie und Onkologie bei der Wirkstoffentwicklung. Durch die Quantifizierung der Aufnahmeeffizienz können Forscher mechanistische Hypothesen zur Makrophagenfunktion und zu apoptotischen Signalwegen entlasten. Der Test bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Bewertung immunmodulatorischer Substanzen in präklinischen Modellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen bezüglich der Makrophagen-vermittelten Beseitigung apoptotischer Zellen.
- Operationaler Wert: Klärt die Beteiligung von Signalwegen an der phagozytotischen Signalübertragung mittels receptor-spezifischer Färbung auf.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Target-Validierung phagozytotischer Marker wie Croquemort zur Identifizierung von Leitstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die Wirkstoff-Screening vor, indem Baseline-Werte für die Aufnahmeaktivität etabliert werden.
- Quantitative Auswertung: Ermöglicht die standardisierte Messung der Internalisierung von apoptotischen Körpern mittels chromogener Signal-Kolokalisation.
- Reproduzierbarkeit des Screenings: Unterstützt die Assay-Standardisierung durch definierte Antikörpermarkierungs- und Substratreaktionsprotokolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert konservierte Mechanismen der apoptotischen Clearance, die in neurodegenerativen und entzündlichen Krankheitskontexten Anwendung finden.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung über konservierte phagozytotische Mechanismen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Leitet Fortschrittskriterien ab, indem die Zielinteraktion in phagozytotischen Signalwegen quantifiziert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsworkflows, indem sie funktionelle Messgrößen für die Zielbindung immunmodulatorischer Wirkstoffe zwischen der frühen Bestätigung von Hits und den Stadien der Leitstruktur-Optimierung bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Phagozytrezeptorfunktion und apoptotischer Signalwege.
- Screening: Bietet assaysbereite Systeme mit quantifizierbaren Aufnahmeparametern zur Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Erzeugt Dual-Channel-Signale (lila/braun), die eine Analyse der Kolokalisation von Phagozyten und apoptotischen Körpern ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch evolutionär konservierte Mechanismen der makrophagenvermittelten apoptotischen Clearance.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Validierung von Zielstrukturen in der Immunologie und Onkologie über mehrere Krankheitsbereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Zuversicht bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in den apoptotischen Clearance-Wegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Immunfärbungs- und chromogene Nachweisschritte sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine frühe Beurteilung des Wirkens immunmodulatorischer Zielstrukturen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert die risikoadjustierte Priorisierung von Substanzen, die die phagozytische Funktion in Immun-Onkologie-Pipelines beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Immunhistochemie und der fluoreszierenden bzw. chromogenen Mikroskopie.
- Basiert auf Nachweissystemen, die auf alkalischer Phosphatase und Peroxidase unter Verwendung geeigneter Substrate beruhen.
- Erfordert die Standardisierung der Antikörpertitration und Inkubationszeiten über verschiedene Labore hinweg.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Validierung phagozytärer Marker in Nicht-Drosophila-Modellsystemen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört eine mögliche Signalüberlappung, die eine sorgfältige spektrale Trennung beim Nachweis erfordert.
Biopharma FAQs
Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Mit Terminal-Transferase-vermittelten dUTP Assays Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7 Maßnahme epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ein In-vivo-Assay zur Quantifizierung der bakteriellen Phagozytose bei adulten Drosophila-Fliegen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in Drosophila Embryonen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026