Der In-vitro-Reporter-Assay für eine einzelne Eizelle: Eine Technik zur Untersuchung der Regulation der Ziel-mRNA-Translation während der In-vitro-Eizellreifung

Eizellen in der Prophase-I-Phase der Meiose sind transkriptionell aktiv; sie produzieren mRNAs und speichern diese in ruhender Form. Während der Reifung, wenn die Eizelle in die Metaphase eintritt, werden die gespeicherten mRNAs in Proteine übersetzt.

Um die Translation von mRNA zu untersuchen, beginnen Sie mit Prophase-I-fixierten Maus-Eizellen, die in einem Tropfen Medium suspendiert sind. Positionieren Sie die Haltepipette in der Nähe einer einzelnen Eizelle, um sie in Position zu halten.

Nehmen Sie eine Mikroinjektionspipette mit einer Reportermischung. Diese Mischung enthält zwei unterschiedliche Arten von mRNA, eine, die für gelb fluoreszierendes Protein oder YFP kodiert - ein Reporter, der mit der 3'-untranslatierten Region des Zielgens fusioniert ist - und eine polyadenylierte mRNA, die für rot fluoreszierendes Protein kodiert.

Injizieren Sie die Reportermischung in die Eizelle. Inkubieren Sie die mikroinjizierten Eizellen in einem Reifungsmedium, das mit Cilostamid ergänzt ist - einem chemischen Inhibitor, der den Prophase-I-Arrest aufrechterhält.

Die Eizelle translatiert polyadenylierte mRNA, bis die Intensität der roten Fluoreszenz ein Plateau erreicht, während die Spiegel der YFP-kodierenden mRNA ohne Polyadenylierungsschwanz unverändert bleiben.

Übertragen Sie die behandelten Eizellen in ein Reifungsmedium ohne Cilostamid, das hilft, die Meiose wieder aufzunehmen; und die Ziel-mRNA wird übersetzt, um das Zielprotein zu produzieren, das mit gelb fluoreszierendem Reporter fusioniert ist.

Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung durch, um die Fluoreszenzsignale in regelmäßigen Abständen zu visualisieren.

Injizierte Eizellen zeigen konstante Mengen an roter Fluoreszenz, während die gelbe Fluoreszenz mit der Zeit zunimmt, was auf eine Translation und allmähliche Akkumulation der Reporterproteine hinweist.

Öffnen Sie zunächst vorsichtig die Antralfollikel, indem Sie mit einer 26-Gauge-Nadel einen kleinen Schnitt in die Follikelwand machen. Isolieren Sie intakte KOK mit mehreren Schichten von Kumuluszellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette. Verwenden Sie eine kleinere Pipette und entblößen Sie die KOK mechanisch durch wiederholtes Pipettieren.

Aspirieren Sie die entblößten Eizellen und legen Sie sie in eine Petrischale mit Reifungsmedium, das mit 1 Mikromolar Cilostamid versetzt ist. Stellen Sie die Schale für zwei Stunden in einen Inkubator, damit sich die Eizellen von dem Stress erholen können, der durch ihre Isolierung von den Follikeln verursacht wird.

Platzieren Sie ein 10 Zentimeter langes Kapillarrohr aus Borosilikatglas und einen mechanischen Abzieher, um die Injektionsnadeln vorzubereiten. Biegen Sie die Nadelspitze in einem 45-Grad-Winkel mit einem beheizten Filament für eine optimale Injektion. Geben Sie 20 Mikroliter basisches Eizellentnahmemedium in eine Styroporschale und bedecken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl.

Bereiten Sie eine größere Menge Reportermischung vor, indem Sie jeweils 12,5 Mikrogramm pro Mikroliter Ypet UTR und mCherry hinzufügen. Lagern Sie Aliquots davon bei minus 80 Grad Celsius. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie das Aliquot zwei Minuten lang bei 20.000 x g und überführen es dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Füllen Sie die Injektionsnadel mit ca. 0,5 Mikrolitern Reportermischung. Legen Sie die Haltepipette und die Injektionsnadel in die Halterungen und positionieren Sie sie in den Tropfen des Eizellsammelmediums.

Öffnen Sie die Injektionsnadel, indem Sie vorsichtig gegen die Haltepipette klopfen. Legen Sie die Eizellen in einen Tropfen basischem Entnahmemedium und injizieren Sie 5 bis 10 Pikoliter der Reportermischung. Inkubieren Sie die Eizellen 16 Stunden lang mit 1 mikromolaren Cilostamid, damit das mCherry-Signal ein Plateau erreicht.

Für die Zeitraffermikroskopie bereiten Sie für jeden injizierten Reporter eine Petrischale mit zwei 20-Mikroliter-Tröpfchen Reifungsmedium vor. Ein Tröpfchen mit 1 mikromolaren Cilostamid zur Kontrolle von Prophase-I-fixierten Eizellen und ein Tröpfchen ohne Cilostamid zur Reifung von Eizellen. Bedecken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl und geben Sie sie in den Inkubator.

Nach der Vorinkubation nehmen Sie die injizierten Eizellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie viermal in Reifemedium ohne Cilostamid. Bewahren Sie einige Eizellen in Reifungsmedium mit 1 mikromolaren Cilostamid als Prophase-I-Eizellkontrollgruppe auf.

Übertragen Sie die injizierten Eizellen in ihre jeweiligen Tröpfchen auf der zuvor vorbereiteten Zeitraffer-Mikroskopschale. Gruppieren Sie die Eizellen mit einer geschlossenen Glaspipette, um zu verhindern, dass sie sich während der Aufnahme bewegen.

Stellen Sie die Schüssel unter das Mikroskop, das mit einem Leuchtdiodenbeleuchtungssystem ausgestattet ist, und einen motorisierten Tisch, der mit einer Klimakammer ausgestattet ist, die bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird, wobei die im Textmanuskript genannten Parameter verwendet werden.

Geben Sie die entsprechenden Einstellungen für das Zeitrafferexperiment ein, indem Sie auf "Apps" und dann auf "Mehrdimensionale Erfassung" klicken. Wählen Sie auf der ersten Registerkarte "Main" und wählen Sie "Zeitraffer", "Mehrere Tischpositionen" und "Mehrere Wellenlängen".

Wählen Sie den Reiter "Speichern", um den Speicherort einzugeben, an dem das Experiment gespeichert werden soll. Wählen Sie dann den Reiter "Zeitraffer", um die Anzahl der Zeitpunkte, die Dauer und das Zeitintervall einzugeben. Wählen Sie den Reiter "Bühne". Schalten Sie das Hellfeld ein und lokalisieren Sie die Position der Eizellen, indem Sie ein neues Fenster öffnen und "Erfassen", "Erfassen" und "Live anzeigen" auswählen.

Sobald die Eizellen lokalisiert sind, wechseln Sie zurück zum "Multidimensionalen Aufnahmefenster" und drücken Sie "+", um die Position der Eizellen festzulegen. Wählen Sie den Reiter "Wellenlängen" und stellen Sie drei verschiedene Wellenlängen für Hellfeld, YFP und mCherry ein. Passen Sie die Belichtung für Ypet und mCherry an. Starten Sie dann das Zeitraffer-Experiment, indem Sie auf "Erfassen" klicken.

Zur Analyse der UTR-Translation von Ypet-3' führen Sie zwei Regionenmessungen für jede Eizelle durch. Die Eizelle selbst, indem Sie auf "Ellipsenregion" clippen, und eine kleine Region, die die Eizelle umgibt, um sie für die Hintergrundsubtraktion zu verwenden, indem Sie auf "Rechteckiger Bereich" klicken. Exportieren Sie die Messdaten der Region in eine Tabelle, indem Sie auf "Protokoll öffnen" und dann auf "Protokolldaten" klicken.

Für jede einzelne Eizelle und für alle gemessenen Zeitpunkte wird die Messung der Hintergrundregion von der Messung der Eizellregion getrennt für die Wellenlängen YFP und mCherry abgezogen.