JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 7:16 Min. • July 8th, 2025
Eizellen in der Prophase-I-Phase der Meiose sind transkriptionell aktiv; sie produzieren mRNAs und speichern diese in ruhender Form. Während der Reifung, wenn die Eizelle in die Metaphase eintritt, werden die gespeicherten mRNAs in Proteine übersetzt.
Um die Translation von mRNA zu untersuchen, beginnen Sie mit Prophase-I-fixierten Maus-Eizellen, die in einem Tropfen Medium suspendiert sind. Positionieren Sie die Haltepipette in der Nähe einer einzelnen Eizelle, um sie in Position zu halten.
Nehmen Sie eine Mikroinjektionspipette mit einer Reportermischung. Diese Mischung enthält zwei unterschiedliche Arten von mRNA, eine, die für gelb fluoreszierendes Protein oder YFP kodiert - ein Reporter, der mit der 3'-untranslatierten Region des Zielgens fusioniert ist - und eine polyadenylierte mRNA, die für rot fluoreszierendes Protein kodiert.
Injizieren Sie die Reportermischung in die Eizelle. Inkubieren Sie die mikroinjizierten Eizellen in einem Reifungsmedium, das mit Cilostamid ergänzt ist - einem chemischen Inhibitor, der den Prophase-I-Arrest aufrechterhält.
Die Eizelle translatiert polyadenylierte mRNA, bis die Intensität der roten Fluoreszenz ein Plateau erreicht, während die Spieg
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