JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:01 Min. • July 8th, 2025
Der Tränenfilm - die Schutzflüssigkeit, die das Auge bedeckt - hilft, die Hornhautepithelzellen der Augen, CECs, zu befeuchten und in einem gesunden, stoffwechselaktiven Zustand zu halten. Ein beeinträchtigter Tränenfilm, wie bei der Krankheit des trockenen Auges, kann dazu führen, dass Tränenflüssigkeiten aus CECs verdunsten, wodurch ihre Anfälligkeit für Infektionen und entzündliche Schäden erhöht wird.
Künstliche Tränenformulierungen stabilisieren den Tränenfilm und verbessern die Wasserretention, wodurch eine Austrocknung der Zellen verhindert wird.
Um die zytotoxischen Wirkungen einer Testformulierung mit künstlichem Tränenfluss auf CECs unter Verwendung des alamarBlue Assays zu untersuchen, beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur von CECs menschlichen Ursprungs in geeigneten Medien. Entsorgen Sie die Medien.
Inkubieren Sie die Zellkultur mit einer bestimmten Konzentration der künstlichen Tränenformulierung. Die Tränenformulierung bildet eine Beschichtung über den Zellen. Abhängig von der kumulativen Wirkung der Bestandteile können die Zellen einen Verlust der Stoffwechselaktivität erfahren.
Als nächstes fügen Sie alamarBlue-Lösung hinzu, die Resazurin enthält, einen blau gefärbten, schwach fluoreszierenden, ungiftigen, wasserlöslichen Farbstoff.
Resazurin diffundiert in die Zellen und wird in stoffwechselaktiven Zellen vor allem durch mitochondriale Reduktasen irreversibel reduziert, da es Elektronen von den Elektronendonatoren der Atmungs- und Stoffwechselprozesse aufnimmt und ein rosafarbenes, stark fluoreszierendes Resorufin bildet, das sich frei aus den Zellen in die Lösung bewegt. Übertragen Sie die Resorufin-haltige Lösung auf eine frische Multiwell-Platte.
Messen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Reader die Fluoreszenzintensität. Ein niedriger Fluoreszenzintensitätswert deutet auf eine geringe zelluläre Stoffwechselaktivität hin, was auf unerwünschte Wirkungen der Tränenformulierung auf CECs hindeutet.
Nehmen Sie die Nährmedien aus den Vertiefungen und behandeln Sie die Zellen sofort mit 150 Mikrolitern einer Testformulierung oder einer Medienkontrolllösung. Inkubieren Sie die Zellen dann 30 Minuten lang.
Entfernen Sie die Testlösung aus den Zellen und fügen Sie 0,5 Milliliter 10%ige metabolische Farbstofflösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für weitere vier Stunden.
Entfernen Sie nach der Inkubation 100 Mikroliter Farbstofflösung aus jeder Vertiefung und geben Sie sie auf eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um die Fluoreszenz jedes Wells zu messen, indem Sie die Anregung auf 540 Nanometer und die Emission auf 590 Nanometer einstellen.