JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:21 Min. • July 8th, 2025
Der Mitteldarm des Insekts enthält eine kupferne Zellregion - CCR - die für die Versauerung des Darms verantwortlich ist. In dieser Region befinden sich spezialisierte sekretorische Zellen - Kupferzellen -, die Säure produzieren, die durch den schmalen Kanal strömt, der von den benachbarten interstitiellen Zellen gebildet wird. Die Säure wird in das Darmlumen abgegeben, um die Verdauung zu unterstützen.
Um die Darmversauerung bei Drosophila zu überwachen, nehmen Sie erwachsene Fliegen, die über einen angemessenen Zeitraum ausgehungert sind. Legen Sie die Fliegen in eine Petriplatte, die einen einzigen Tropfen Fliegenfutter enthält, das mit Bromphenolblau oder BPB - einem pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff - angereichert ist. Lassen Sie die ausgehungerten Fliegen für einen bestimmten Zeitraum nach Futter suchen.
Nach der Nahrungsaufnahme gelangt die von den Kupferzellen produzierte Säure in das Darmlumen und vermischt sich mit der BPB-haltigen Nahrung. Bei einem sauren pH-Wert protonieren die BPB-Moleküle, wodurch sich ihre Farbe von blau nach gelb ändert - was auf eine Versauerung hinweist.
Legen Sie die Petriplatte nach Ablauf der Versuchsdauer auf Eis. Eine niedrige Temperatur stoppt die neuromuskuläre Aktivität der Fliegen und betäubt sie. Legen Sie eine einzelne Fliege unter ein Stereomikroskop und isolieren Sie den intakten Verdauungstrakt chirurgisch.
Untersuchen Sie die CCR-Farbe, um den Status der Darmversauerung zu bestimmen. Eine gelbe Färbung zeigt die Versauerung an, während eine blaue Färbung das Fehlen einer Versauerung anzeigt.
Untersuchen Sie den Verdauungstrakt aller Fliegen und berechnen Sie den Prozentsatz der Individuen, die eine Darmübersäuerung aufweisen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Assays zur Überwachung der Darmsäuerung mit der Zubereitung des Fliegenfutters mit pH-empfindlichem Bromphenolblau oder BPB-Farbstoff. Dazu das Fliegenfutter in der Mikrowelle schmelzen und lauwarm abkühlen lassen. 1 Milliliter 4% BPB zu 1 Milliliter des lauwarmen Futters mit einer Rührmulde geben. Geben Sie mit einer Pipette das BPB-haltige Fliegenfutter in einen einzigen Punkt von ca. 200 Mikrolitern in der Mitte einer Petrischale.
Sammeln Sie als Nächstes 0 bis 2 Tage alte, nicht junge, weibliche Drosophila melanogaster-Fliegen und lassen Sie die Fliegen sich auf Standard-Maismehlfutter erholen. Lassen Sie die Fliegen vor dem Experiment 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Fläschchen mit einem Labortuch aushungern, das mit etwa 2 Millilitern entionisiertem Wasser getränkt ist.
Verhungerte Fliegen werden in eine Petrischale gegeben, die einzelne Punkte des frisch zubereiteten Fliegenfutters enthält, das mit 2 % BPB angereichert ist, damit die Fliegen vier Stunden lang bei Raumtemperatur und unter Lichteinwirkung nach Nahrung suchen können.
Nach vier Stunden sammeln Sie die Fliegen. Fahren Sie dann mit der chirurgischen Isolierung der Eingeweide der anästhesierten Fliegen in 1x PBS mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop fort. Zähle die Anzahl der Fliegen, die eine robuste BPB-Färbung in den Eingeweiden zeigen, und berechne den Prozentsatz anhand der Gleichung.