Löslicher Proteinassay zur Quantifizierung des Gehalts an löslichen Proteinen in Pflanzengeweben

Um den Gehalt an löslichen Proteinen in einem Pflanzengewebe in einem Röhrchen zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer angemessenen Menge an gemahlenem, lyophilisiertem Pflanzengewebe.

Geben Sie Natriumhydroxid, ein Alkali, in das Rohr und beschallen Sie. Das alkalische Milieu mit den mechanischen Kräften zerrüttet die Zellen und setzt intrazelluläre Inhalte frei, darunter Makromoleküle - lösliche Proteine und Kohlenhydrate. Inkubieren Sie bei höheren Temperaturen.

In Gegenwart von Hitze verursachen Alkalien eine Proteinhydrolyse, die kleinere Peptide bildet und die Löslichkeit des Proteins erhöht. Zusätzlich werden Kohlenhydrate abgebaut.

Zentrifugieren Sie die Mischung. Sammeln Sie den löslichen proteinhaltigen Überstand. Fügen Sie Salzsäure hinzu, um den pH-Wert zu neutralisieren.

Behandeln Sie die Probe mit Trichloressigsäure, TCA. TCA zerstört die Hydrathülle, die die Proteine umgibt, was zu Proteinaggregation und -fällung führt.

Zentrifugieren und den TCA-haltigen Überstand entfernen. Waschen Sie das Proteinpellet mit eiskaltem Aceton, um TCA-Reste zu entfernen, die die Schätzung löslicher Proteine beeinträchtigen könnten.

Trockne das Aceton an der Luft. Resuspendieren Sie das Proteinpellet in Natriumhydroxid. Mit entionisiertem Wasser verdünnen. In die Vertiefungen einer Multi-Well-Platte umfüllen.

Fügen Sie eine saure Lösung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 hinzu. Unter sauren Bedingungen bindet der Farbstoff an die basischen Aminosäurereste in den solubilisierten Proteinen, wodurch ein blauer Protein-Farbstoff-Komplex entsteht.

Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Absorption des Protein-Farbstoff-Komplexes zu messen, proportional zum Gehalt an löslichen Proteinen im Pflanzengewebe

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Wiegen Sie zunächst Replikproben jedes Gewebes in markierte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ab. Notieren Sie als Nächstes die genaue Masse jeder Probe. Geben Sie mit einer Mikropipette 500 Mikroliter 0,1 molares Natriumhydroxid in jedes Röhrchen. Schließen Sie die Deckel fest und beschallen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang.

Legen Sie die Röhren anschließend für 15 Minuten in ein vorgewärmtes Heißwasserbad. Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 g für 10 Minuten. Pipettieren Sie den Überstand in neue markierte Mikrozentrifugenröhrchen mit einer neuen Pipettenspitze für jede Probe.

Geben Sie 300 Mikroliter 0,1 molares Natriumhydroxid zum Pellet und wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten. Entfernen Sie danach den Überstand und geben Sie ihn in die Röhrchen mit dem Überstand aus der ersten Zentrifugation.

Um den pH-Wert des Überstands zu neutralisieren, fügen Sie 11 Mikroliter 5,8 molare Salzsäure hinzu. Verwenden Sie Lackmuspapier, um zu bestätigen, dass der pH-Wert etwa 7 beträgt.

Geben Sie anschließend 90 Mikroliter 100% Trichloressigsäure in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen dann 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie vorsichtig eine Vakuumleitung und eine Mikropipettenspitze aus Glas, um die Trichloressigsäure zu entfernen.

Achten Sie sehr darauf, das Pellet nicht mit der Saugspitze zu stören.

Waschen Sie anschließend das Pellet mit 100 Mikrolitern Aceton, das auf minus 20 Grad Celsius abgekühlt ist. Lassen Sie dann das Aceton in einem Abzug verdampfen. Lösen Sie das Proteinpellet mit 1 Milliliter Natriumhydroxid auf. Zusätzliche Runden des Erhitzens, Vortexens und Beschallens können erforderlich sein.

Geben Sie 160 Mikroliter jeder IgG-Standardlösung in dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-Platte, beginnend mit der Position A1. Geben Sie anschließend in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen 50 Mikroliter jeder Probenlösung zu 950 Mikrolitern destilliertem Wasser. Geben Sie dann 60 Mikroliter jeder verdünnten Probe in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungsplatte, beginnend mit der H1-Position. Geben Sie 100 Mikroliter destilliertes Wasser in alle leeren und unbekannten Probenvertiefungen.

Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 40 Mikroliter Coomassie Brilliant Blue G-250 Proteinfarbstoff in jede Vertiefung der Platte. Lösen Sie mit einer Nadel alle Blasen, die sich in den Vertiefungen befinden. Lassen Sie die Platte danach 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie dann ein Mikrotiterplatten-Spektralphotometer, um die Absorptionswerte für jede Vertiefung bei 595 Nanometern aufzuzeichnen.