JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:34 Min. • July 8th, 2025
Toxoplasma gondii - ein einzelliges Protozoon - ist ein obligat anaerober Parasit, der sich nur in Wirtszellen fortpflanzt.
Um das intrazelluläre Wachstum des Parasiten mit einem Luciferase-basierten Assay zu quantifizieren, nehmen Sie eine Suspension von Parasitenzellen, die Luciferase exprimieren - ein Enzym, das bei Reaktion mit seinem Substrat Lumineszenz erzeugt. Geben Sie die Suspension in eine Kultur menschlicher Vorhautfibroblasten und inkubieren Sie sie für eine angemessene Dauer.
Der Parasit bindet an die Rezeptoren der Wirtszellen und wird über einen endozytären Prozess internalisiert, wodurch eine parasitophore Vakuole gebildet wird. Die Struktur bietet dem Parasiten eine Nische, in der er sich vermehren kann.
Nach der Infektion das Medium absaugen und die nicht internalisierten Parasiten entfernen. Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, der ein Detergens und Luciferin enthält - ein Substrat für Luciferase. Das Detergens im Puffer schafft Poren in der Zellmembran und lysiert die Zellen vollständig, was zur Freisetzung von Luciferase führt.
Das freigesetzte Enzym oxidiert Luciferin-Moleküle und emittiert Licht. Messen Sie die Lumineszenzintensität, um die Luziferase-Aktivität
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