Luciferase-basierter Wachstumsassay zur Quantifizierung der intrazellulären Parasitenreproduktion

Toxoplasma gondii - ein einzelliges Protozoon - ist ein obligat anaerober Parasit, der sich nur in Wirtszellen fortpflanzt.

Um das intrazelluläre Wachstum des Parasiten mit einem Luciferase-basierten Assay zu quantifizieren, nehmen Sie eine Suspension von Parasitenzellen, die Luciferase exprimieren - ein Enzym, das bei Reaktion mit seinem Substrat Lumineszenz erzeugt. Geben Sie die Suspension in eine Kultur menschlicher Vorhautfibroblasten und inkubieren Sie sie für eine angemessene Dauer.

Der Parasit bindet an die Rezeptoren der Wirtszellen und wird über einen endozytären Prozess internalisiert, wodurch eine parasitophore Vakuole gebildet wird. Die Struktur bietet dem Parasiten eine Nische, in der er sich vermehren kann.

Nach der Infektion das Medium absaugen und die nicht internalisierten Parasiten entfernen. Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, der ein Detergens und Luciferin enthält - ein Substrat für Luciferase. Das Detergens im Puffer schafft Poren in der Zellmembran und lysiert die Zellen vollständig, was zur Freisetzung von Luciferase führt.

Das freigesetzte Enzym oxidiert Luciferin-Moleküle und emittiert Licht. Messen Sie die Lumineszenzintensität, um die Luziferase-Aktivität zu bestimmen. Messen Sie die Luciferase-Aktivität unter Verwendung von Replikatvertiefungen mit infizierten Wirtszellen in festgelegten Intervallen nach der Infektion.

Plotten Sie die normierte Lumineszenzintensität über die Zeitintervalle, um die Faltenänderungen des Parasitenwachstums im Laufe der Zeit zu erhalten. Ein zeitlicher Anstieg der Intensität deutet auf eine erfolgreiche Parasitenvermehrung hin.

Stellen Sie die Werte in einer logarithmischen Skala dar, um die Steigung der Kurve zu berechnen, die die Verdopplungszeit des Parasiten darstellt.

Um einen Luciferase-basierten Toxoplasma-Wachstumsassay durchzuführen, beginnen Sie mit der sorgfältigen Aspiration des Mediums aus vorgesäten 96-Well-Mikrotiterplattenkulturen menschlicher Vorhautfibroblasten und inokulieren Sie 150 Mikroliter parasitenfreie Suspension in einem dreispaltigen und fünfreihigen Format in die Vertiefungen.

Nach einer vierstündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung, um die nicht eingedrungenen Parasiten zu entfernen, und füllen Sie die Vertiefungen in jeder außer der ersten Reihe mit phenolrotfreiem Medium bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 100 Mikroliter einer 12,5 mikromolaren Luciferase-Substratlösung in PBS in jede Vertiefung der oberen Reihe und inkubieren Sie die Mikrotiterplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine vollständige Zelllyse zu ermöglichen.

Messen Sie am Ende der Inkubation die Luciferase-Aktivität auf einem Mikroplatten-Reader. Jeder Messwert stellt die anfängliche Anzahl der eingedrungenen Parasiten vier Stunden nach der Infektion dar. Wiederholen Sie die Analyse in den nächsten vier Tagen alle 24 Stunden, ohne das Medium zu wechseln.

Um die normalisierte Faltenänderung des Parasitenwachstums zu berechnen, kann jeder Messwert durch den Anfangsmesswert vier Stunden nach der Infektion dividiert werden. Der log2 der normierten Faltungsänderung des Parasitenwachstums kann dann gegen jeden Zeitpunkt aufgetragen und einer linearen Regressionsfunktion unterzogen werden, um die Steigung zu erhalten, die die Verdopplungszeit darstellt.