Msp1-Extraktionsassay zur Untersuchung der Entfernung von fehllokalisierten TA-Proteinen

Msp1, eine ATPase in der mitochondrialen Außenmembran, entfernt über ihre hexamere zentrale Pore fehllokalisierte schwanzverankerte Proteine (TA) aus der Membran und erleichtert so deren Abbau.

Um den Mechanismus der Translokation zu verstehen, co-rekonstituieren Sie TA-Proteine und Msp1 in Liposomen, was deren Integration in die Lipiddoppelschicht ermöglicht.

Bereiten Sie eine Reaktionsmischung vor, indem Sie die rekonstituierten Liposomen zu einem geeigneten Puffer hinzufügen, der Chaperone – zytosolische Qualitätskontrollproteine – enthält. Die Chaperone sind mit der Glutathion-S-Transferase oder dem GST-Enzym markiert.

Fügen Sie der Reaktion Adenosintriphosphat – ATP – hinzu. Das Msp1 bindet an die ATP-Moleküle und hydrolysiert sie. Mit Hilfe der durch Hydrolyse erzeugten Energie transloziert Msp1 die membrangebundenen TA-Proteine durch seine zentrale Pore. Die Chaperone im Reaktionsgemisch binden an die Transmembrandomäne der extrahierten TA-Proteine.

Laden Sie anschließend das Reaktionsgemisch auf eine Affinitätsreinigungssäule. Die Säule enthält ein Harz, das mit reduziertem Glutathion oder GSH konjugiert ist. Das GST-Protein auf den Chaperonen bindet an das konjugierte GSH