Kalzifizierungsassay zur Messung der Kalziumkonzentration in interstitiellen Zellen der Aortenklappe

Aortenklappensegel enthalten eine heterogene Population von interstitiellen Klappenzellen (VICs), die über die extrazellulären Matrixschichten verteilt sind. Nach der Stimulation verwandeln sich VICs in Osteoblasten – Knochenmatrix-bildende Zellen.

Reife Osteoblasten sezernieren Kollagen und Knochenmatrixproteine. Diese Proteine helfen den Osteoblasten, sich an die Matrix zu binden. Schließlich gelangen intrazelluläre Calciumionen in das Matrixmilieu und lagern sich zusammen mit Phosphaten als mineralisierte Knötchen ab, was zu einer Verkalkung der Aortenklappe führt.

Um die Kalziumkonzentration in verkalkten Aortenklappen zu bestimmen, beginnen Sie mit einer Kultur von VICs in einer Sechs-Well-Platte. Entsorgen Sie das Nährmedium, geben Sie ein osteogenes Medium in die Vertiefung und inkubieren Sie.

Während der Inkubation regt Insulin im osteogenen Medium die VICs an, sich in osteogene Phänotypen zu differenzieren. Diese Osteoblasten sezernieren Knochenmatrixproteine und Ascorbinsäure im osteogenen Medium, was sie dazu veranlasst, eine kollagenreiche extrazelluläre Matrix zu bilden.

Schließlich bilden das intrazelluläre Kalzium der Osteoblasten und die Phosphate des Mediums mineralisierte Kristalle im Medium.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie die Salzsäurelösung hinzu. Inkubieren, um die Kalziumionen in die Lösung zu lösen. Geben Sie das saure Medium, das Kalzium enthält, in die Vertiefung einer Multi-Well-Platte.

Fügen Sie einen kalziumempfindlichen Farbstoff hinzu und inkubieren Sie. Die Farbstoffmoleküle binden an die Calcium-Ionen im sauren Medium und bilden einen violett gefärbten Farbstoff-Calcium-Komplex.

Messen Sie die Extinktion des Komplexes, die proportional zur Kalziumkonzentration in der Probe ist.

Reinigen Sie vor Beginn des Assays die Biosicherheitshaube mit 70 % Ethanol und erwärmen Sie das DMEM-Medium auf 37 Grad Celsius. Anschließend werden 100.000 Zellen pro Bedingung in 6-Well-Platten in vollständigem DMEM ausgesät und bei 37 Grad Celsius kultiviert.

Ersetzen Sie nach 24 Stunden das überstehende Medium durch das verkalkende Medium und inkubieren Sie die Zellen 7 Tage lang bei 37 Grad Celsius, wobei Sie das Medium am dritten Tag austauschen.

Messen Sie nach 7 Tagen die Kalziumkonzentration in einer 96-Well-Platte mit dem Arsenazo III-Reagenz und zeichnen Sie die Extinktion bei 650 Nanometern auf.