Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM_{2,5-vermittelten} DNA-Schäden in Fischembryonen

Im Zebrafisch verursacht Feinstaub (PM) – ein Luftschadstoff – eine durch oxidativen Stress verursachte Herzfunktionsstörungen.

Um die Auswirkungen von PM auf den Zebrafisch zu untersuchen, beginnen Sie damit, Zebrafischembryonen PM-abgeleitetem, extrahierbarem organischem Material, EOM, auszusetzen, das die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auslöst.

ROS oxidiert die DNA-Base Guanin zu 8-Hydroxy-2'-Desoxyguanosin oder 8-OHdG und bewirkt bei der Phosphorylierung von Histon H2AX die Bildung von γH2AX – einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche.

Nach der Belichtung das Zebrafischherz sezieren und auf einen Objektträger legen. Behandeln Sie das Herz mit einer Fixierlösung, die die Proteine vernetzt und die Zellstruktur stabilisiert.

Fügen Sie als Nächstes ein blockierendes Reagenz hinzu, um unspezifische Bindungsstellen zu verhindern. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf γH2AX und 8-OHdG in den Herzzellen abzielen.

Fügen Sie als Nächstes zwei verschiedenfarbige fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzu, die spezifisch an die Fc-Region ihres jeweiligen Primärantikörpers binden. Färben Sie die Probe schließlich mit DAPI – einer DNA-spezifischen Färbung –, die an die kleine Rille von AT-reichen Sequenzen in der DNA bindet, um einen fluoreszierenden Komplex zu bilden.

Legen Sie den Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop, um die Signale der 8-OHdG- und γH2AX-Expression in den Herzen der EOM-behandelten Zebrafischembryonen zu beobachten.

Eine signifikant hohe Fluoreszenzintensität der Herzzellen deutet auf EOM-induzierte oxidative DNA-Schäden und Doppelstrangbrüche hin.

Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis auf einen sauberen Objektträger. Fügen Sie 50 Mikroliter 4% Paraformaldehyd zu 1,25 Mikrolitern PBS hinzu, um eine Fixierlösung herzustellen. Legen Sie dann drei präparierte Herzen in einen hydrophoben Barrierekreis und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben mindestens 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Rutschen dreimal in PBST, 5 Minuten pro Waschgang. Fügen Sie 50 Mikroliter BSA zu 1.000 Mikrolitern PBST hinzu, um eine 5%ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang in einer feuchten Kammer, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.

Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal 5 Minuten lang pro Waschgang mit PBS. Verdünnen Sie zwei Mikroliter eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen 8-Hydroxy-Desoxyguanosin und zwei Mikroliter eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen gamma-H2AX in 296 Mikrolitern PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktail-Lösung zu erhalten.

Inkubieren Sie die Herzproben mit 50 Mikrolitern der primären Antikörper-Cocktail-Lösung in einer befeuchteten Kammer für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal 5 Minuten lang pro Waschgang mit PBST. Verdünnen Sie 1 Mikroliter FITC-markierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper und 1 Mikroliter cy3-Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 500 Mikrolitern PBST, um eine funktionierende Sekundärantikörper-Cocktaillösung zu erhalten.

Inkubieren Sie die Proben mit den Sekundärantikörpern 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal 5 Minuten lang pro Waschgang mit PBS. Geben Sie 20 Mikroliter DAPI zu den Proben für die Kernfärbung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Kleben Sie ein Deckglas auf den Objektträger und versiegeln Sie ihn mit Nagellack, um ein Austrocknen und Verrutschen zu verhindern.

Bilden Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop ab und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software. Berechnen Sie die relativen Änderungen anhand des Durchschnitts der DMSO-Kontrollstichproben und bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Daten.