Wundassay zur Bewertung der Migrationskapazität von murinen Myoblasten in Co-Kultur

Als Reaktion auf eine Wunde produzieren sekretorische Zellen parakrine Signalmoleküle, um Myoblasten – undifferenzierte Muskelzellen – zu aktivieren. Aktivierte Myoblasten wandern in Richtung der Wundstelle, wo sie sich vermehren und die Wunde heilen lassen.

Um die Migrationskapazität von Myoblasten in vitro zu bewerten, nehmen Sie eine Multiwell-Platte, die eine konfluente Monoschicht aus murinen Myoblasten enthält. Kratzen Sie mit einer Pipettenspitze die Monoschicht ein, um ein lineares, zellfreies Pflaster im Inneren der Vertiefung zu erzeugen, das die Wundstelle simuliert.

Ergänzen Sie die Vertiefung vorsichtig mit dem Nährmedium, ohne das Wundpflaster zu stören.

Nehmen Sie ein membranöses Insert, das eine adhärente Kultur von Neuralleistenzellen oder NCCs – sekretorischen Zellen – in einem geeigneten Medium enthält. Platzieren Sie den Einsatz in der Vertiefung, so dass sich die NCCs an der Basis in der Nähe des Wundpflasters befinden. Inkubieren Sie die Co-Kultur für die gewünschte Dauer.

Während der Inkubation setzen die NCCs Signalmoleküle frei, die an die spezifischen Rezeptoren auf den Myoblasten binden und so eine Signalkaskade in Gang setzen. Diese Signalübertragung erleichtert die Reorganisation von Aktinen in den Myoblasten, und als Ergebnis entwickeln diese Zellen an ihren Rändern zytoplasmatische Projektionen wie Lamellipodien und Filopodien. Diese Projektionen helfen den Myoblasten, in Richtung des verwundeten Bereichs zu wandern und sich allmählich wieder zu bevölkern, was zu einer Wundheilung führt.

Legen Sie die Platte unter ein Mikroskop und beobachten Sie die Wundheilung, deren Ausmaß mit der Migrationskapazität von Myoblasten in Co-Kultur korreliert.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen, entfernen Sie das überstehende Medium aus der C2C12-Kammervertiefung und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.

Beginnen Sie nach dem Entfernen des PBS mit dem Kratzen der Zellen, indem Sie eine sterile P10-Pipettenspitze fest in eine Richtung führen, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen. Sobald die Zellen zerkratzt sind, fügen Sie schnell 1 Milliliter PBS hinzu.

Schalten Sie als Nächstes den Computer und das Mikroskop ein. Platzieren Sie den Kammerschlitten auf dem Tisch und drehen Sie das Objektivrad auf 5-fache Vergrößerung. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, klicken Sie auf die Registerkarte "Kamera" und dann auf die Schaltfläche "Live", um die Zellen auf der Registerkarte "AxioCam IC" zu visualisieren.

Stellen Sie sicher, dass der Lichtfilter ganz herausgezogen ist, damit das Licht auf die Kamera und den Computerbildschirm gelangen kann. Bewegen oder drehen Sie den Kammerschieber manuell, um den gewickelten Bereich in der Mitte des Livebildes auf der Registerkarte "AxioCam IC" zu positionieren. Um Bilder aufzunehmen, klicken Sie auf "Snap", um eine Registerkarte "Neu" neben der Registerkarte "AxioCam IC" zu öffnen, die das Bild enthält.

Um dieses Standbild zu speichern, klicken Sie auf "Datei", wählen Sie "Speichern unter" und wählen Sie "Desktop" in der linken Leiste, um die Datei auf dem Desktop zu speichern. Geben Sie den "Dateinamen" in das Feld "Dateiname" ein und speichern Sie die Abbildung im Dateiformat ".czi".

Um das Bild als ".tiff" zu speichern, klicken Sie auf "Datei", wählen Sie "Speichern unter", geben Sie den "Dateinamen" in das Feld für den Dateinamen ein, klicken Sie auf die Schaltfläche "Dateityp" und wählen Sie "*.tiff" aus dem Dropdown-Menü.

Positionieren Sie den Objektträger manuell neu, um zwei bis drei weitere Bilder an anderen Stellen der Wunde im selben Vertiefung aufzunehmen. Entfernen Sie nach der Bildgebung das PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie 1 Milliliter C2C12-Medium hinzu.

Bauen Sie das Well-Insert-Co-Kultursystem zusammen, indem Sie die Einsätze mit den O9-1-Zellen manuell in jede Vertiefung der Kammervertiefung einsetzen. Schieben Sie die Einsätze vorsichtig nach unten in die Vertiefung, so dass der Boden des Einsatzes knapp über den darunter liegenden C2C12-Zellen sitzt. Bringen Sie die Well-Insert-Konstrukte wieder in den Inkubator zurück, und lassen Sie die Zellen insgesamt 9 bis 12 Stunden lang wandern.

Um die optimale Migrationszeit zu bestimmen, überprüfen Sie die Zellen sechs Stunden nach der Wundbildung und danach alle zwei bis drei Stunden. Beenden Sie das Experiment, wenn die Zellen unter Kontrollbedingungen die Wunde vollständig bedecken.