Warum wird ELISA verwendet, um die Antikörper-Antigen-Konjugation zu überprüfen?

Der ELISA bestätigt die erfolgreiche Konjugation, indem er die Bildung von Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexen über eine farbmetrische Reaktion nachweist. Dies liefert ein quantitatives, spezifisches Signal, das zwischen konjugierten und nicht konjugierten Spezies unterscheidet. Die Methode unterstützt Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch in der Konjugatentwicklung, indem sie die Zugänglichkeit des Epitops nach der Vernetzung überprüft.

Wie verbessert die Blockierungslösung die Genauigkeit des ELISA bei der Überprüfung der Konjugation?

Die Blockierung verhindert unspezifische Bindung von Antikörper-Antigen-Konjugaten an die Oberfläche der ELISA-Platte und verringert so das Hintergrundsignal. Dadurch wird sichergestellt, dass das detektierte Signal ausschließlich der spezifischen Bindung zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Antigen-Epitop entspricht. Eine verbesserte Spezifität erhöht die Zuverlässigkeit bei der Quantifizierung der Konjugationseffizienz.

Was misst die spektrophotometrische Analyse in diesem ELISA-Protokoll?

Die Spektrophotometrie misst die Absorption des farbigen Produkts, das durch die Enzym-Substrat-Reaktion erzeugt wird und mit der Menge des gebundenen enzymgebundenen Antikörpers korreliert. Dies liefert einen quantitativen Messwert, der proportional zur Konzentration der Antikörper-Antigen-Konjugate in jedem Well ist. Die Daten ermöglichen den Vergleich über Verdünnungsreihen hinweg, um die Konjugationseffizienz zu bewerten.

Warum wird bei der ELISA-Verifizierung eine serielle Verdünnung von Antikörper-Antigen-Konjugaten verwendet?

Die serielle Verdünnung erzeugt eine Standardkurve, um die Konjugationseffizienz über einen Konzentrationsbereich von hoch bis niedrig zu quantifizieren. Dies ermöglicht es Forschenden, die Nachweisgrenze zu bestimmen und die Empfindlichkeit des Assays zu bewerten. Die Verdünnungsreihe ermöglicht die Interpolation unbekannter Probenkonzentrationen und stellt sicher, dass die Ergebnisse innerhalb des dynamischen Bereichs des Assays liegen.

Welches spezifische enzymgekoppelte Antikörper wird in diesem ELISA zur Detektion verwendet?

Ein mit Peroxidase aus Rettich (horseradish peroxidase) konjugierter Antikörper gegen das Anti-DEC-205/OVA-Konjugat wird verwendet, um den im Antigen-Antikörper-Komplex vorhandenen primären Antikörper nachzuweisen. Dieser enzymgekoppelte Antikörper bindet spezifisch an die Fc-Region oder das Idiotop des gebundenen Antikörpers im Konjugat. Das Enzym Peroxidase aus Rettich katalysiert anschließend eine chromogene Reaktion, die eine spektrophotometrische Detektion ermöglicht.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay zur Verifizierung chemisch gekoppelter Antikörper-Antigen-Konjugate

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Techniken

0 Ansichten • 2:57 Min. • July 8th, 2025

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Um eine Immunantwort auszulösen, binden Antigene an die Antikörper, die spezifisch für die endozytären Rezeptoren sind, die auf der Oberfläche der dendritischen Zellen vorhanden sind, oder DCs – die antigenpräsentierenden Zellen –, die bei der Aufnahme von Antigenen helfen.

Die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes ist ein entscheidender Schritt und kann in vitro durch chemische Kopplung des Antigens an einen monoklonalen Antikörper erreicht werden, der auf DC abzielt.

Um die Effizienz des Konjugationsprozesses zu überprüfen, beginnen Sie mit einer ELISA-Platte, die mit den eingefangenen Antikörpern vorbeschichtet ist. Behandeln Sie die Platte mit einer Blockierungslösung, um eine unspezifische Bindung der Antigene an die beschichtete Oberfläche zu verhindern.

Chemisch vernetzte Antikörper-Antigen-Konjugate auf die Platte geben und inkubieren. Das spezifische Epitop des Antigens interagiert mit dem Paratop des eingefangenen Antikörpers und bildet einen Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex.

Überlagern Sie die Platte anschließend mit einem dritten Satz von Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind. Diese Antikörper binden spezifisch an die im Konjugat vorhandenen primären Antikörper und ermöglichen so dessen Nachweis.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der das chromogene Substrat enthält, um die Konjugate sichtbar zu machen. Das an den Antikörper gebundene Enzym reagiert mit dem Substrat und erzeugt das farbige Produkt.

Behandeln Sie die Platte mit einer angesäuerten Inaktivierungslösung, die das Enzym inaktiviert und die Reaktion beendet. Analysieren Sie die Platte spektrophotometrisch. Das Vorhandensein einer farbigen Lösung bestätigt das Vorhandensein von Antikörper-Antigen-Konjugaten und bestätigt die erfolgreiche Konjugation.

Um den Erfolg der Konjugation durch ELISA zu überprüfen, beschichten Sie eine geeignete 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikrolitern des Anti-OVA-Antikörpers pro Well und verdünnen Sie Anti-DEC-205/OVA seriell im Verhältnis 1:2 in Blockierungspuffer, um Verdünnungen von 6 Mikrogramm pro Milliliter auf 93,8 Nanogramm pro Milliliter zu erhalten.

Geben

Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen der mit Antikörpern beschichteten Platte für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation werden 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper gegen das Anti-DEC-205/OVA-Konjugat auf die Platte gegeben, um eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur durchzuführen.

Geben Sie dann 50 Mikroliter Meerrettichperoxidase-Substrat in jede Vertiefung, um die Analyse der Farbreaktion durch Spektrophotometrie zu ermöglichen.