Enzyme-Linked Immunosorbent Assay zur Verifizierung chemisch gekoppelter Antikörper-Antigen-Konjugate

Um eine Immunantwort auszulösen, binden Antigene an die Antikörper, die spezifisch für die endozytären Rezeptoren sind, die auf der Oberfläche der dendritischen Zellen vorhanden sind, oder DCs – die antigenpräsentierenden Zellen –, die bei der Aufnahme von Antigenen helfen.

Die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes ist ein entscheidender Schritt und kann in vitro durch chemische Kopplung des Antigens an einen monoklonalen Antikörper erreicht werden, der auf DC abzielt.

Um die Effizienz des Konjugationsprozesses zu überprüfen, beginnen Sie mit einer ELISA-Platte, die mit den eingefangenen Antikörpern vorbeschichtet ist. Behandeln Sie die Platte mit einer Blockierungslösung, um eine unspezifische Bindung der Antigene an die beschichtete Oberfläche zu verhindern.

Chemisch vernetzte Antikörper-Antigen-Konjugate auf die Platte geben und inkubieren. Das spezifische Epitop des Antigens interagiert mit dem Paratop des eingefangenen Antikörpers und bildet einen Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex.

Überlagern Sie die Platte anschließend mit einem dritten Satz von Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind. Diese Antikörper binden spezifisch an die im Konjugat vorhandenen primären Antikörper und ermöglichen so dessen Nachweis.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der das chromogene Substrat enthält, um die Konjugate sichtbar zu machen. Das an den Antikörper gebundene Enzym reagiert mit dem Substrat und erzeugt das farbige Produkt.

Behandeln Sie die Platte mit einer angesäuerten Inaktivierungslösung, die das Enzym inaktiviert und die Reaktion beendet. Analysieren Sie die Platte spektrophotometrisch. Das Vorhandensein einer farbigen Lösung bestätigt das Vorhandensein von Antikörper-Antigen-Konjugaten und bestätigt die erfolgreiche Konjugation.

Um den Erfolg der Konjugation durch ELISA zu überprüfen, beschichten Sie eine geeignete 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikrolitern des Anti-OVA-Antikörpers pro Well und verdünnen Sie Anti-DEC-205/OVA seriell im Verhältnis 1:2 in Blockierungspuffer, um Verdünnungen von 6 Mikrogramm pro Milliliter auf 93,8 Nanogramm pro Milliliter zu erhalten.

Geben

Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen der mit Antikörpern beschichteten Platte für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation werden 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper gegen das Anti-DEC-205/OVA-Konjugat auf die Platte gegeben, um eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur durchzuführen.

Geben Sie dann 50 Mikroliter Meerrettichperoxidase-Substrat in jede Vertiefung, um die Analyse der Farbreaktion durch Spektrophotometrie zu ermöglichen.