Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Die Exposition gegenüber schädlichen Stoffen führt zu einzel- und doppelsträngigen Brüchen in der zellulären DNA, die zu DNA-Schäden führen.

Um DNA-Schäden zu erkennen, beginnen Sie mit einer Einzelzellsuspension chemisch behandelter Zellen in verflüssigter, niedrigschmelzender Agarose. Laden Sie die Suspension auf einen Objektträger und lassen Sie die Agarose erstarren – was die Immobilisierung der Zellen in der porösen Gelmatrix ermöglicht.

Behandeln Sie die Zellen mit Lysepuffer. Die Detergenzien im Puffer lösen die Zell- und Kernmembranen auf, während die Salze die Histone aus der DNA entfernen und einen Nukleoidkörper bilden, der DNA enthält, die an die Kernmatrix gebunden ist.

Inkubieren Sie die Objektträger in einem alkalischen Elektrophoresepuffer. Dies führt dazu, dass sich die DNA abwickelt und einzelsträngige Fragmente entstehen. Legen Sie den Objektträger in ein Elektrophoresegerät und schließen Sie es an die Stromversorgung an. Dies ermöglicht die Migration von negativ geladener DNA zur positiven Anode.

Die unbeschädigte DNA bleibt im Nukleoidkörper eingeschränkt. Im Gegensatz dazu beginnen sich die kleineren, beschädigten DNA-Fragmente in Richtung Anode zu bewegen. Diese differentielle Bewegung bildet eine kometenähnliche Struktur, in der die unbeschädigte DNA den Kopf bildet, während die beschädigte DNA den Kometenschweif bildet.

Inkubieren Sie den Objektträger in einem Neutralisationspuffer, damit die einzelsträngigen DNA-Fragmente renaturieren können. Behandeln Sie als Nächstes den Objektträger mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der die DNA färbt. Visualisieren Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Die Intensität und Länge des Schwanzes korrelieren mit dem Grad der zellulären DNA-Schädigung.

Bereiten Sie zunächst 0,6 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in PBS vor und legen Sie es in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Beschriften Sie das mattierte Ende der vorbeschichteten Objektträger mit Name, Datum und Behandlungsinformationen mit einem Permanentmarker oder Bleistift.

Stellen Sie eine Kühlplatte auf eine flache Bank und legen Sie zwei gefrorene Kühlakkus in die Schiebeschublade unter der Metalloberfläche. Legen Sie dann die Objektträger auf die Kühlplatte, um sie 1 bis 2 Minuten vorzukühlen. Zentrifugieren Sie, entfernen Sie den Überstand aus den Probenröhrchen und legen Sie sie sofort wieder auf Eis. Das Zellpellet mit 200 Mikrolitern 0,6 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt resuspendieren und durch Pipettieren mischen.

Geben Sie als Nächstes 80 Mikroliter agarosehaltige Zellen auf einen gekühlten Objektträger und legen Sie schnell ein Deckglas auf das Gel. Lassen Sie das Gel 1 bis 2 Minuten auf der Kühlplatte aushärten. In der Zwischenzeit 500 Milliliter Arbeitslösung des Lysepuffers vorbereiten und in die Lyseschale gießen.

Nachdem die Gele ausgehärtet sind, entfernen Sie die Deckgläser schnell, indem Sie den Objektträger vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger halten und das Deckglas vom Gel schieben. Legen Sie dann die Objektträger in einen Objektträger, wobei alle schwarzen Punktmarkierungen auf den Objektträgern in die gleiche Richtung zeigen. Platzieren Sie den Objektträgerträger in der Lyseschale. Schließen Sie den Deckel der Lyseschale und stellen Sie sie zur Inkubation.

Nehmen Sie den Objektträgerträger vorsichtig aus der Lyseschale, ohne die Gele zu stören. Legen Sie den Objektträgerträger vorsichtig in eine Spülschüssel, die mit eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser vorgefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass die Folien vollständig untergetaucht sind, und lassen Sie das Setup 30 Minuten lang stehen.

Legen Sie ein gefrorenes Kühlpaket unter den Elektrophoresetank, um die optimale Puffertemperatur aufrechtzuerhalten. Geben Sie dann eiskalte Elektrophorese-Arbeitslösung in den Tank und übertragen Sie den Objektträgerträger hinein. Richten Sie die Objektträger so aus, dass die Zelle mit den Gelen zur Kathode zeigt.

Inkubieren Sie die Objektträger 20 Minuten lang im Elektrophoresetank, damit sich die DNA abwickeln kann. Schalten Sie dann das Netzteil ein, um eine Elektrophorese für 20 Minuten bei 1,19 Volt pro Zentimeter durchzuführen. Schalten Sie nach Abschluss der Elektrophorese die Stromversorgung aus und entfernen Sie den Objektträgerträger aus dem Elektrophoresetank. Lassen Sie den Objektträger 30 Sekunden lang auf Seidenpapier abtropfen.

Legen Sie dann den Objektträgerträger in eine Schale mit Neutralisationspuffer und lassen Sie ihn 20 Minuten einwirken. Legen Sie es anschließend in eine Spülschüssel mit eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie es 20 Minuten einwirken. Nehmen Sie nach dem Waschen den Objektträgerträger aus dem Wasser und lassen Sie die Objektträger 1 Stunde lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius trocknen.

Um die Objektträger zu rehydrieren, stellen Sie den Objektträgerträger in eine Spülschüssel mit eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie ihn 30 Minuten lang stehen. Legen Sie dann den Objektträgerträger in eine Färbeschale mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodidlösung.

Schließen Sie den Deckel der Färbeschale und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation den Objektträgerträger in eine separate Schüssel geben und 20 Minuten lang mit eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser waschen.

Nehmen Sie den Objektträger aus der Schale und trocknen Sie ihn vollständig im Dunkeln, entweder in einem 37 Grad heißen Inkubator oder bei Raumtemperatur. Nachdem die Objektträger vollständig getrocknet sind, bewahren Sie sie in einer Objektträgerbox im Dunkeln auf, bis sie für die Bildanalyse bereit sind.