Pyruvat-Assay zur Abschätzung des Pyruvatgehalts in zellulären Fraktionen von Würmern

Der zelluläre Gehalt an Pyruvat – einem wichtigen Zwischenprodukt in energieerzeugenden biochemischen Stoffwechselwegen – kann mit enzymbasierten kolorimetrischen Assays abgeschätzt werden.

Um den Pyruvatgehalt in den Zellen von Caenorhabditis elegans – einem nicht-parasitären Nematoden – zu bestimmen, nehmen Sie eine zelluläre Fraktion, die aus adulten Würmern hergestellt wurde, die Pyruvat enthalten. Behandeln Sie die Lösung, entfernen Sie zelluläre Proteine und sammeln Sie die geklärte zelluläre Fraktion – die Testprobe – die Pyruvat enthält. Das Fehlen von zellulären Proteinen gewährleistet eine genaue Bestimmung des Pyruvatspiegels.

Beginnen Sie mit der Zugabe eines Arbeitsreagenzes, das die Enzyme Pyruvatoxidase und Meerrettichperoxidase sowie einen chromogenen Farbstoff enthält. Inkubieren Sie die Mischung im Dunkeln für eine angemessene Dauer.

Während der Inkubation reagiert die Pyruvatoxidase mit Pyruvat – ihrem Substrat – und erzeugt als Nebenprodukt Wasserstoffperoxid. Die Abwesenheit von Licht verhindert die spontane Zersetzung von Wasserstoffperoxid.

Meerrettichperoxidase katalysiert die Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem chromogenen Farbstoff, wodurch ei