Spektrophotometrischer Assay zur Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität

Die Glykogensynthase – ein entscheidendes Enzym bei der Glykogensynthese – spaltet Uridindiphosphat-Glukose oder UDP-Glukose – einen Nukleotidzucker – in UDP- und Glykosylreste und fügt das freigesetzte Glukosemonomer der wachsenden Glykogenkette hinzu.

Um die Glykogensynthase-Aktivität abzuschätzen, beginnen Sie mit der Einnahme eines Reaktionsgemisches, das Glykogen, UDP-Glukose, ATP, Phosphoenolpyruvat und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid oder NADH enthält, in einem Röhrchen. Fügen Sie das Kinase-Enzym Nukleosiddiphosphat oder NDP sowie einen Cocktail aus Pyruvatkinase und Laktatdehydrogenase hinzu. Mischen Sie den Inhalt und inkubieren Sie.

Geben Sie eine Glykogensynthase-haltige Probe in das Röhrchen, um die enzymatische Reaktion zu initiieren.

Die Glykogensynthase wirkt auf UDP-Glukose und erzeugt UDP und einen Glykosylrest. Das Enzym nimmt das freie Glukosemonomer auf und baut es in die Glykogenkette des Reaktionsgemisches ein. In Gegenwart von ATP phosphoryliert die NDP-Kinase des Reaktionsgemischs das ungenutzte UDP, wandelt es in UTP um und erzeugt ADP.

Das Enzym Pyruvatkinase wirkt auf ADP und fügt ein Phosphat hinzu, das durch das Phosphoenolpyruvat des Reaktionsgemisches abgegeben wird, um ATP und Pyruvat zu produzieren. Als nächstes wandelt die Laktatdehydrogenase das Pyruvat in Laktat um und oxidiert NADH während der Reaktion.

Messen Sie die Abnahme der NADH-Absorption bei 340 nm, um die Menge an verbrauchtem NADH zu quantifizieren, was auf eine erfolgreiche Enzymaktivität hinweist.

Um mit der Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität zu beginnen, tauen Sie die zuvor hergestellten Stammlösungen von UDP-Glukose, ATP, Phosphoenolpyruvat und NDP-Kinase auf Eis auf. Ein Wasserbad auf 30 Grad Celsius vorheizen.

Wenn die Stammlösungen fertig sind, bereiten Sie eine ausreichende Assay-Mischung entsprechend der Anzahl der Glykogensynthase-Assays vor, indem Sie die Reagenzien in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie eine Blindreaktion vor, indem Sie das NADH aus dem Reaktionsgemisch durch das Wasser ersetzen und die Reaktion in eine Einweg-Methacrylatküvette übertragen. Verwenden Sie die Blindreaktion, um auf dem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 340 Nanometern "Null" zu setzen.

Nehmen Sie ein Aliquot von 770 Mikrolitern des Reaktionsgemisches in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und geben Sie nacheinander jeweils 2 Mikroliter NDP-Kinase und Pyruvatkinase/Laktat-Dehydrogenase-Gemisch in das Röhrchen.

Nach dem vorsichtigen Mischen das Röhrchen bei 30 Grad Celsius im Wasserbad 3 Minuten lang inkubieren, um das Reaktionsgemisch vorzuwärmen. Fügen Sie dann 30 Mikroliter der Probe, die Glykogensynthase enthält, in 20 Millimolar Tris-Puffer bei pH 7,8 hinzu und mischen Sie vorsichtig, bevor Sie das Reaktionsgemisch in eine Einweg-Methacrylatküvette überführen.

Legen Sie die Küvette in das Spektralphotometer und zeichnen Sie die Extinktion bei 340 Nanometern in zeitlich festgelegten Intervallen für 10 bis 20 Minuten auf. Plotten Sie dann die erhaltenen Absorptionen gegen die Zeit auf.