JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:00 Min. • July 8th, 2025
Während einer Influenzavirusinfektion dringt das Virus durch Endozytose in die Zelle ein und kapert die Wirtszellmaschinerie, wodurch Nachkommenvirionen produziert werden. Diese werden freigesetzt, infizieren benachbarte Zellen und verursachen eine Kaskade von Infektionen.
Um das Verhältnis von infektiösen Influenzaviren zu Zellen in Kultur – die Vielzahl der Infektionen – zu messen, geben Sie eine geeignete Dichte an frisch gewonnener Säugetierzellsuspension in eine Mikrotiterplatte.
Die Platte enthält impedanzmessende Gold-Mikroelektroden, die in den Bohrlochboden eingelassen sind. Inkubieren, so dass die Zellen am Boden der Vertiefung haften und die exponentielle Wachstumsphase vor der Infektion erreichen können.
Legen Sie ein kleines elektrisches Potential zwischen den Mikroelektroden an. Zellen, die auf die Mikroelektroden geklebt sind, wirken als Isolatoren, die den Stromfluss begrenzen und den elektrischen Widerstand – die Impedanz – erhöhen, die gemessen wird.
Entfernen Sie das Medium. Pipettieren Sie die Suspension des Influenzavirus in die Vertiefungen. Ergänzen Sie mit einer geeigneten Serin-Endoprotease.
Während der Inkubation spaltet und aktiviert die Serin-Endoprotease das virale Glykoprotein Hämagglutinin, wodurch seine Bindung an spezifische Wirtszellrezeptoren und der anschließende Eintritt in die Viruszellen erleichtert wird.
Mit Hilfe der Wirtszellmaschinerie werden neue Viruspartikel produziert und freigesetzt, die benachbarte Zellen infizieren. Infolgedessen durchlaufen die virusinfizierten Zellen morphologische Veränderungen und zeigen zytopathische Wirkungen, die zum Zelltod führen – Zellen lösen sich von der Mikroelektrodenoberfläche, wodurch die Impedanz mit der Zeit abnimmt.
Bestimmen Sie die Zeit, die benötigt wird, bis die Impedanz auf die Hälfte der ursprünglichen Impedanz reduziert ist, bevor das Virus hinzugefügt wird. Ein kürzerer Zeitrahmen deutet auf eine höhere Multiplizität von Virusinfektionen hin.
Um die Korrelation zwischen den CIT50-Werten und der Vielzahl der Infektionen zu bestimmen, waschen Sie die Zellen nach der Kultivierung von 3 x 104 frisch gespaltenen MDCK-Zellen in jede Wand der elektronischen Mikrotiterplatte für 24 Stunden zweimal mit 100 Mikrolitern frischem Virusvermehrungsmedium pro Vertiefung und Waschgang und fügen Sie mit einer Einkanalpipette 100 Mikroliter Virussuspension in jede Vertiefung hinzu.
Wenn alle Virusverdünnungen hinzugefügt wurden, laden Sie die Platte vorsichtig bei 35 Grad Celsius in die Halterungstasche des Instruments und beginnen Sie mit der Überwachung der Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden, wie gezeigt.
Klicken Sie nach zwei Messzyklen auf "Pause" und entfernen Sie die E-Platte aus der Halterung. Geben Sie 100 Mikroliter Virusvermehrungsmedium, das mit TPCK-Trypsin angereichert ist, in jede Vertiefung und legen Sie die E-Plattenplatte wieder in die Halterungstasche. Starten Sie dann die Analyse.