Zellulärer impedanzbasierter Überlebenskinetik-Assay zur Beurteilung des Überlebens von Viren

Viren binden an den Rezeptor der Wirtszelle und internalisieren es in ein Endosom. Die endosomale Membran verschmilzt mit der Virusmembran und setzt den viralen Inhalt in der Zelle frei.

Im Zellkern angekommen, wird das virale Genom in mRNA umgewandelt und später in virale Proteine übersetzt. Die viralen Bestandteile dringen in das Zytoplasma ein und lagern sich zu Virionen zusammen, die aus der Zelle herauskneifen und zytopathische Wirkungen verursachen – Veränderungen in der Morphologie der Wirtszelle und den Tod.

Um die Überlebenskinetik des Virus durch Messung der Wirtszellimpedanz zu beurteilen, nehmen Sie eine Multiwell-Platte, die an der Unterseite mit Mikroelektroden zur Impedanzmessung beschichtet ist. Geben Sie eine Wirtszellsuspension in die Vertiefungen und inkubieren Sie, damit die Zellen an der Elektrodenoberfläche haften und wachsen können.

Nehmen Sie als nächstes mit Kochsalzlösung vorbehandelte Virussuspensionen mit unterschiedlicher Viruslast ein. Die Kochsalzbehandlung versorgt das Virus mit Chlorid, das hypochlorige Säure produziert, die es abtötet – wodurch die Infektiosität des Virus verringert wird. Geben Sie diese Virussuspensionen in ihre jeweiligen Vertiefungen.

Messen Sie die zelluläre Impedanz – ein Phänomen, bei dem der elektrische Stromfluss durch die Elektroden entgegenwirkt – durch die anhaftenden Zellen.

Viren infizieren adhärente Wirtszellen und verändern deren Morphologie, wodurch sich die gemorphten Zellen von den Elektroden lösen. Im Laufe der Zeit, wenn mehr Zellen infiziert werden, nimmt die durch Wirtszellen vermittelte zelluläre Impedanz ab.

Plotten Sie den Zellindex, d. h. die Änderung der Impedanz aufgrund der Ablösung infizierter Zellen, im Laufe der Zeit.

Um die Überlebenskinetik des Influenza-A-Virus zu beurteilen, fügen Sie Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 35 Gramm pro Liter in destilliertem Wasser hinzu und geben Sie 900 Mikroliter der resultierenden Kochsalzlösung in 2-Milliliter-Kryoröhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter Virusmaterial in jedes Kryoröhrchen und legen Sie die Röhrchen für den entsprechenden Versuchszeitraum in den 35-Grad-Inkubator.

Am Tag vor dem Ende der Inkubation werden 3 x 10⁴ frisch gespaltene MDCK-Zellen in 100 Mikroliter Virusvermehrungsmedium pro Vertiefung in eine 16-Well-Mikrotiterplatte ausgesät und die Schritte wiederholt, die die Messung der Hintergrundimpedanz und die gleichmäßige Verteilung der Zellen auf dem Boden der Vertiefungen ermöglichen. Lassen Sie die Zellen dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid wachsen.

Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal, infizieren Sie die Zellen dann mit 100 Mikrolitern des salzdestillierten Virus, das 10-mal in frischem Kulturmedium verdünnt wird, wie gezeigt, und überwachen Sie die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden.