Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen zur Beurteilung von oxidativem Stress im Humanserum

Zellen erzeugen bei Stoffwechselprozessen geringe Mengen an freien Radikalen.

Unter pathologischen Zuständen kommt es zu einer Überproduktion freier Radikale, die oxidativen Stress verursacht. Diese freien Radikale greifen mehrfach ungesättigte Fettsäuren in den Phospholipiden der Zellmembran in einem Prozess an, der als Lipidperoxidation bezeichnet wird. Dabei entstehen giftige Oxidationsprodukte, darunter Lipidhydroperoxide und Malondialdehyd (MDA), die Membranschäden und Zelltod verursachen.

Um oxidativen Stress in Humanserum in vitro mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay (TBARS) nachzuweisen, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit Humanserum, das mit einer oxidationsinduzierenden Verbindung behandelt wurde. Das behandelte Serum besteht hauptsächlich aus Lipidperoxidationsprodukten – MDA und Lipidhydroperoxiden – sowie Phospholipiden, Lipiden und Proteinen.

Als nächstes fügen Sie Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzu und mischen Sie, um die Lipide zu lösen und das MDA freizusetzen. SDS denaturiert alle kontaminierenden Proteine. Fügen Sie einen geeigneten sauren Puffer hinzu, gefolgt von saurer Thiobarbitursäure (TBA). Bei hoher Temperatur inkubieren.

Unter sauren Bedingungen und hohen Temperaturen reagieren TBA-Moleküle mit MDA und bilden einen stabilen rot-rosa MDA-TBA-Komplex, der als TBARS bezeichnet wird. Inkubieren Sie auf Eis, um die Reaktion zu stoppen und die bestehenden Komplexe zu stabilisieren.

Zentrifuge. Sammeln Sie den MDA-TBA-haltigen Überstand und überführen Sie ihn in eine Multi-Well-Platte. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption des Komplexes.

Eine höhere Absorption deutet auf eine hohe TBARS-Konzentration hin, was auf einen höheren Gehalt an Lipidperoxidationsprodukten und oxidativem Stress im Serum hinweist.

Beschriften Sie die Glasröhrchen für die zu analysierenden Proben und geben Sie dann 100 Mikroliter der vorbereiteten Probe in jedes Röhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter 8,1 % SDS zu jeder Probe und schwenken Sie das Glasröhrchen vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um es zu mischen.

Geben Sie 1,5 Milliliter 3,5 molaren Natriumacetatpuffer zu jeder Probe. Fügen Sie dann 1,5 Milliliter wässrige 0,8%ige Thiobarbitursäurelösung hinzu. Bringen Sie das endgültige Volumen in jedem Röhrchen auf 4 Milliliter, indem Sie 700 Mikroliter entionisiertes Wasser hinzufügen. Verschließen Sie die Glasröhren fest und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang in einem Heizblock auf 95 Grad Celsius. Decken Sie die Rohre mit Alufolie ab, um Kondensation zu vermeiden. Nehmen Sie dann die Röhrchen aus dem Block und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben und Standards bei 1.500 x g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Übertragen Sie 150 Mikroliter Überstand aus jedem Röhrchen in eine Vertiefung in einer 96-Well-Platte und entfernen Sie alle Luftblasen mit einer Pipettenspitze.

Messen Sie die Extinktion der Proben bei 532 Nanometern. Subtrahieren Sie dann den durchschnittlichen Absorptionswert der Blindproben von allen anderen Absorptionswerten.

Erstellen Sie eine Standardkurve und verwenden Sie sie, um unbekannte Probenkonzentrationen zu berechnen.