Zeitaufgelöster Forster-Resonanz-Energietransfer zur Überwachung der Proteinphosphorylierung in Zellen
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 5:13 Min. • July 8th, 2025
Die Phosphorylierung bestimmter zellulärer Proteine ist ein wichtiger Regulationsmechanismus, der zu ihrer Aktivierung oder Deaktivierung führt.
Um die spezifische Proteinphosphorylierung zu überwachen, nehmen Sie eine Kulturplatte mit adhärenten Zellen. Behandeln Sie die Zellen mit einem Stimulator, um die Phosphorylierung der Proteine in den Zellen zu fördern. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium und fügen Sie einen Zelllysepuffer und einen Phosphatasehemmer-Cocktail hinzu.
Die Pufferkomponenten bewirken eine Zelllyse, bei der der zelluläre Inhalt zusammen mit phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Proteinen freigesetzt wird. Der Inhibitor-Cocktail inaktiviert die zelluläre Phosphatase, so dass die phosphorylierten Proteine intakt bleiben.
Übertragen Sie das Zelllysat in eine Detektionsplatte mit geringem Volumen. Behandeln Sie das Lysat mit den Donor- und Akzeptor-Antikörpern, die an verschiedene lichtempfindliche Fluorophore gebunden sind.
Während der Inkubation erkennen die Donor-Antikörper ein spezifisches Epitop auf dem Testprotein, wodurch sie die phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Varianten des Proteins binden können. Im Gegensatz dazu binden die Akzeptor-An
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