Digitale Duplex-PCR zur gleichzeitigen Quantifizierung dualer genetischer Marker

Die Duplex-Kettenreaktion der digitalen Polymerase – ddPCR – ermöglicht den gleichzeitigen quantitativen Nachweis von zwei unterschiedlichen genetischen Markern.

Entnehmen Sie zunächst eine Probe mit zwei verschiedenen Zielsequenzen. Fügen Sie eine Mischung hinzu, die ein thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym, dNTPs und zielspezifische Primer enthält. Fügen Sie als Nächstes zwei verschiedene zielspezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit fluoreszierenden Reportern und einem Quenchermolekül markiert sind, um amplifizierte Ziele zu detektieren.

Die Lösung wird mit Öl emulgiert, um die Zielsequenzen in zahlreiche Nanotröpfchen aufzuteilen. Jedes Tröpfchen, das das Ziel enthält, fungiert als einzelnes Reaktionsgefäß.

Starten Sie den thermischen Zyklusprozess für die Amplifikationsreaktion in den einzelnen Nanotröpfchen.

Bei einer hohen Denaturierungstemperatur trennen sich die doppelsträngigen Targets in Einzelstränge.

Senken Sie die Temperatur, um die entsprechende Glühtemperatur zu erreichen, damit die Primer und Oligonukleotidsonden an die Vorlage binden können.

Die Nähe des Quenchers unterdrückt die Fluoreszenz des Reporters. Bei der Verlängerungstemperatur dehnt die DNA-Polymerase die Primer aus und spaltet die Oligonukleotidsonde. Der ungebundene Reporter emittiert Fluoreszenz.

Führen Sie die Tröpfchen durch einen Tröpfchenleser – ein Fluoreszenzdetektionssystem. Die Detektion von einfacher oder doppelter Fluoreszenz weist auf positive Tröpfchen hin, die Ziele enthalten, während das Fehlen eines Signals auf negative Tröpfchen hinweist.

Das Verhältnis der positiven Tröpfchen zur Gesamtzahl der Partitionen bestimmt die Anfangskonzentration der Zielsequenzen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zunächst Stammkonzentrationen von 100 Mikromol pro Liter für alle Primer in molekularem Wasser und Sonden in TE pH 8-Puffer vor, wie im Protokolltext beschrieben. Bereiten Sie als Nächstes einen Mastermix vor, indem Sie geeignete Mengen an digitalem PCR-Mix, Vorwärts- und Rückwärtsprimern, der Fluoreszenzsonde und nukleasefreiem Wasser mischen. Pipettieren Sie mindestens 10 Mal auf und ab, um zu mischen, und achten Sie dabei darauf, keine Luftblasen in die Lösung zu bringen.

Da der dPCR-Mastermix viskoser ist als der herkömmliche qPCR-Mastermix, ist es notwendig, die Mischtechnik durch Pipettieren zu verwenden, um eine homogene Lösung zu erhalten. Dies ermöglicht eine genaue nachgelagerte dPCR-Quantifizierung.

Um die Assay-Mischung für die Tröpfchenerzeugung herzustellen, um Proben in Duplikaten laufen zu lassen, pipettieren Sie 36 Mikroliter des Mastermixes in eine normale PCR-Platte. Mischen Sie zu jedem der 36-Mikroliter-Mastermixe 12 Mikroliter DNA-Template und lassen Sie die entsprechenden Replikatvertiefungen auf der Platte leer. Fügen Sie Positivkontrollen hinzu, um sicherzustellen, dass der Assay ordnungsgemäß abläuft. Fügen Sie keine Vorlagensteuerungen oder NTCs hinzu, um sicherzustellen, dass sich keine Kontamination in der Platte befindet, und um die Fluoreszenz-Basislinie später für die Datenanalyse festzulegen.

Mischen Sie die Assay-Mischungen vor dem Einrichten des Tröpfchengenerators, indem Sie die Mischungen mit einer Mehrkanalpipette etwa 15 Mal auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze in der Flüssigkeit bleibt, um übermäßige Blasen in der Mischung zu vermeiden.

Setzen Sie anschließend die erste Kartusche mit acht Vertiefungen in einen weißen Kartuschenhalter ein und klicken Sie den Kartuschenhalter zu. Die erste Kartusche sitzt nun fest und kann nicht aus der Halterung gelöst werden, während Tröpfchen entstehen.

Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 20 Mikroliter der Assay-Mischung in die mittlere Position der Kartusche mit der Aufschrift "Probe", ohne Luftblasen einzuführen. Pipettieren Sie 70 Mikroliter Tröpfchenöl auf die linke Seite der Kartusche mit der Aufschrift "Öl".

Decken Sie die Kartusche mit einer Dichtung ab und achten Sie darauf, dass die Dichtung flach ist und von den vier Häkchen gleichmäßig zum Rand der Kartusche gehalten wird. Drücken Sie die grün leuchtende Taste am Tröpfchengenerator, um die Klappe zu öffnen und die Kartusche einzusetzen. Drücken Sie die Taste erneut, um den Generator zu schließen. Sobald sich die Tür schließt, wird der grüne Knopf gedimmt und die Tür kann nicht wieder geöffnet werden.

Tröpfchenerzeugung beginnt sofort und dauert ca. 1 Minute.

Während die Tröpfchenerzeugung im Gange ist, legen Sie die zweite Kartusche in einen zweiten weißen Kartuschenhalter und bereiten Sie sie auf die gleiche Weise wie die erste Kartusche vor. Wenn die Tröpfchengenerierung abgeschlossen ist, wird die schwach beleuchtete Schaltfläche grün.

Öffnen Sie die Klappe des Tröpfchengenerators. Entfernen Sie den weißen Patronenhalter, in dem sich die erste Patrone befindet, und legen Sie ihn beiseite. Setzen Sie die zweite Kartusche in den Tröpfchengenerator ein.

Entfernen Sie die Dichtung von der ersten Kartusche und entsorgen Sie sie. Lösen Sie den weißen Patronenhalter nicht, da die neu erzeugten Tröpfchen dadurch beschädigt werden können.

Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette auf 40 Mikroliter die Spitzen in einem 45-Grad-Winkel in die dritte Spalte der Patrone ein, die mit den Tröpfchen markiert ist, und pipettieren Sie langsam alle Tröpfchen hoch. Übertragen Sie sie auf die endgültige PCR-Platte, indem Sie die Pipettenspitze etwa auf halber Höhe an die Well-Wand legen und den Tropfen langsam ausstoßen.

Wenn die Tröpfchenerzeugung für Kartusche zwei abgeschlossen ist, entfernen Sie auf die gleiche Weise die Dichtung von Kartusche zwei und übertragen Sie die erzeugten Tröpfchen auf die endgültige PCR-Platte. Legen Sie eine durchstechbare Folienabdeckung auf die Platte und legen Sie sie auf einen Plattenversiegeler. Stellen Sie die Versiegelung auf 180 Grad Celsius ein. Drücken Sie "Play" auf dem Versiegelungsmittel und versiegeln Sie es 10 Sekunden lang.

Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die versiegelte PCR-Endplatte in den Thermocycler. Verwenden Sie einen Thermocycler, der mit der endgültigen PCR-Platte kompatibel ist und eine Temperaturrampengeschwindigkeit von 2 Grad Celsius pro Sekunde aufweist.

Führen Sie das folgende Wärmeprogramm durch: 10 Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 Grad Celsius und 60 Sekunden bei 60 Grad Celsius, gefolgt von einem 10-minütigen Halten bei 98 Grad Celsius. Übertragen Sie die Platte nach Abschluss des Zyklus auf einen Tröpfchenleser, um die Fluoreszenz in jedem Tröpfchen in jeder Vertiefung automatisch zu messen.

Stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen Raumtemperatur haben, bevor Sie mit der Tröpfchenmessung fortfahren. Öffnen Sie zunächst die mitgelieferte Software, um die Tröpfchenlesung einzurichten. Doppelklicken Sie im Standardmenü "Setup", das einen Schaltplan einer leeren 96-Well-Platte enthält, auf Well A1, um das Menü mit den drei Abschnitten "Probe", "Assay 1" und "Assay 2" zu öffnen.

Geben Sie im Beispielabschnitt die Beispiel-ID in das Feld mit der Bezeichnung "Name" ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen rechts mit der Aufschrift "Übernehmen". Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung "Experimentieren". Wählen Sie "ROT" für die Erkennung seltener Ereignisse und klicken Sie auf "Enter".

Verschieben Sie den Abschnitt mit der Bezeichnung "A1". Füllen Sie im Abschnitt "Name" den Assay aus und klicken Sie auf "Enter". Klicken Sie im Feld unten mit der Bezeichnung "Typ" auf das Dropdown-Menü, wählen Sie "Kanal 1 unbekannt" und klicken Sie auf "Enter".

Verschieben Sie den Abschnitt mit der Bezeichnung "A2". Füllen Sie im Abschnitt "Name" den Assay aus und klicken Sie auf "Enter". Klicken Sie im Feld unten mit der Bezeichnung "Typ" auf das Dropdown-Menü, wählen Sie "Channel 2 Unknown" und klicken Sie auf "Enter".

Alle Informationen aus den vorherigen Schritten sind nun in Vertiefung A1 vorhanden.

Benennen Sie alle nachfolgenden Vertiefungen, die Tröpfchen enthalten. Um die gesamte Einrichtungszeit zu sparen, klicken Sie auf "Shift" oder "Control", um mehrere Wells gleichzeitig auszuwählen. Wenn die digitale Darstellung der Platte die physische Platte widerspiegelt, drücken Sie "OK" unten rechts im Menü. Wählen Sie im neuen Menü, das oben im Plattenschaltplan angezeigt wird, im Abschnitt "Vorlage" die Option "Speichern unter" und benennen und speichern Sie die Platte.

Klicken Sie links auf dem Bildschirm auf "Ausführen" und wählen Sie das entsprechende Farbset im Popup-Fenster "Ausführungsoptionen" aus. Die Datenerfassung wird eingeleitet und in Echtzeit in der Software angezeigt.