Quantitative reverse-Transkriptions-PCR in Echtzeit zur Diagnose von Virusinfektionen

Die quantitative reverse-transkription-PCR in Echtzeit ist nützlich für die Identifizierung von Virusinfektionen.

Beginnen Sie mit einer Probe, die die virale Ziel-RNA enthält. Fügen Sie zielspezifische Primer hinzu, die sowohl die DNA-Synthese als auch die Amplifikation unterstützen, zusammen mit reversem Transkriptase-Enzym und dNTPs.

Fügen Sie thermostabile DNA-Polymerase hinzu – ein Enzym zur Amplifikation von DNA über PCR-Zyklen hinweg – und SYBR Green – einen Farbstoff, der in doppelsträngige DNA, dsDNA, interkaliert. Die Reaktion in einen Thermocycler geben. Stellen Sie eine geeignete Temperatur ein, damit die Primer an die Ziel-RNA binden können.

Die reverse Transkriptase fügt dem Primer dNTPs hinzu, während sie gleichzeitig die Matrizen-RNA spaltet und cDNA synthetisiert.

Erhöhen Sie die Temperatur und inaktivieren Sie die reverse Transkriptase. Senken Sie die Temperatur, damit die Primer für die anschließende Amplifikation an der cDNA abgreifen können. Erhöhen Sie die Temperatur, um den Verlängerungsschritt zu erreichen, in dem die DNA-Polymerase die Primer verlängert und dsDNA synthetisiert.

Aufeinanderfolgende Zyklen führen zu einer exponentiellen dsDNA-Amplifikation. SYBR-Grün bindet in zunehmender Zahl an die DNA, was zu einer proportionalen Zunahme der Fluoreszenzemission führt. Plotten Sie das Fluoreszenzsignal, das über die Zyklen hinweg detektiert wurde.

Eine positive Amplifikationskurve zeigt das Vorhandensein von viraler RNA in der Probe an.

Erhöhen Sie die Temperatur schrittweise, um die Schmelztemperatur zu erreichen, und denaturieren Sie die dsDNA in Einzelstränge. Die gebundenen Farbstoffmoleküle werden freigesetzt – und verlieren ihre Fluoreszenz. Plotten Sie die abnehmende Fluoreszenz gegen die Temperatur auf.

Ein Peak, der der virusspezifischen Schmelztemperatur entspricht, bestätigt die Virusinfektion.

Planen Sie das Layout Ihrer PCR-Platte mit einer Tabellenkalkulation und berücksichtigen Sie dabei sowohl Test- als auch Kontrollproben. Bereiten Sie eine PCR-Workstation vor, indem Sie Oberflächen desinfizieren, und schalten Sie bei Verwendung eines UV-Schranks das UV-Licht 10 Minuten vor dem Start ein.

Nehmen Sie Reagenzien und Primer zum Auftauen aus dem Gefrierschrank, aber lassen Sie die Enzymmischung immer auf Eis. Mischen Sie die Reagenzien und zentrifugieren Sie kurz, um die Flüssigkeit aufzufangen. Bereiten Sie PCR-Mastermixe für Lyssavirus und Beta-Aktin gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor. Lassen Sie die Mastermixe bis zur Verwendung auf Eis. Mischen und zentrifugieren Sie die vorbereiteten Mastermixe und geben Sie 19 Mikroliter in die entsprechenden Vertiefungen der PCR-gerätekompatiblen Platte oder des Röhrchenstreifens.

Geben Sie in einem separaten Raum oder einem UV-Schrank vorsichtig 1 Mikroliter der vorbereiteten RNA hinzu. Wenn Sie einen UV-Schrank verwenden, schalten Sie das UV-Licht 10 Minuten vor dem Start ein. Fügen Sie nach den Testproben die Positivkontrolle und die Kontrolle ohne Vorlage hinzu.

Wenn Sie die RNA zu den Mastermixen hinzufügen, stellen Sie sicher, dass sie in die richtige Vertiefung gegeben wird. Verwenden Sie den Plattenplan, um diesen Schritt zu unterstützen.

Verschließen Sie die Platte, vergewissern Sie sich, dass die Deckel flach über der Platte liegen, und drehen Sie sie nach unten, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung das gleiche Flüssigkeitsvolumen hat und keine Blasen sichtbar sind. Übertragen Sie dann die Proben auf das PCR-Gerät.

Öffnen Sie das Programm und wählen Sie "SYBR Green" mit "Dissoziation". Wählen Sie die zu analysierenden Wells aus, indem Sie "Unbekannt" als Probentyp und "SYBR" als Fluoreszenzfarbstoff auswählen. Beschriften Sie die Vertiefungen auf dem Plattenlayout mit den Probeninformationen, einschließlich der Angabe, ob der Assay für die Lyssavirus-Vertiefung oder Beta-Aktin bestimmt ist.

Klicken Sie auf "Thermal Profile Setup" und ändern Sie die Temperaturwechselbedingungen, wie im Manuskript angegeben. Klicken Sie auf "Start", wählen Sie dann einen Speicherort für die Datei aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die Lampe am Ende des Laufs auszuschalten. Wenn die Option zum Starten vor dem Aufwärmen der Lampe angezeigt wird, klicken Sie auf "Jetzt ausführen", aber stellen Sie sicher, dass die Lampe weniger als 15 Minuten zum Aufwärmen hat.