Quantitative Polymerase-Kettenreaktion zur Aufzählung von Bakteriophagen

Um Bakteriophagen mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion, qPCR, aufzuzählen, erhalten Sie einen qPCR-Reaktionscocktail, der Taq-DNA-Polymerase, Primer, Desoxynukleotidtriphosphate – dNTPs – und fluoreszierende Reporterfarbstoffmoleküle in einem optimierten Puffer enthält. In die Vertiefungen einer qPCR-Platte überführen.

Fügen Sie wärmebehandelte Bakteriophagen hinzu. Bei der Wärmebehandlung wird die DNA von Bakteriophagen aus Bakteriophagenpartikeln freigesetzt. Versiegeln Sie die Platte, um die Verdunstung der Mischung zu verhindern. Legen Sie die Platte in das qPCR-System ein und stellen Sie geeignete Zyklusbedingungen ein.

Durch das Erhitzen auf hohe Temperaturen wird die doppelsträngige DNA in Einzelstränge denaturiert. Es aktiviert auch die Taq-DNA-Polymerase. Das Annealing bewirkt, dass sequenzspezifische Primer an die komplementären DNA-Stränge der Bakteriophagen binden. Die Verlängerung ermöglicht es der aktivierten Taq-DNA-Polymerase, dNTPs an das 3'-Ende des Primers anzuhängen, wodurch der wachsende DNA-Strang in 5'- bis 3'-Richtung verlängert wird.

Die Farbstoffmoleküle interkalieren in die neu synthetisierte doppelsträngige DNA, was zu einer erhöhten Fluoresze