Warum verbessert die Mikrokugel-PCR die Target-Validierung?

Die Mikrosphären-PCR erzeugt reine einzelsträngige DNA, indem amplifizierte Sinnesstränge von doppelsträngigen Kontaminanten getrennt werden, wodurch Fehlsignale in hybridisierungsbasierten Assays, die für Target-Engagement-Studien verwendet werden, verringert werden.

Wie unterstützt die asymmetrische Amplifikation in der Mikrokugel-PCR die Identifizierung von Leads?

Die Methode verwendet markierte Primer, um gezielt Sinnesstränge zu synthetisieren, wodurch kontaminationsfreie Einzelstrang-DNA hergestellt wird, was die Zuverlässigkeit von Assays bei der Identifizierung von Leitverbindungen verbessert.

Welche quantitativen Messungen ermöglicht die Mikrosphären-PCR für die präklinische Beurteilung?

Die Mikrokugel-PCR liefert quantifizierbare einsträngige DNA-Amplicons, die für die Quantifizierung mittels Gelelektrophorese geeignet sind und eine konsistente Messung von Genexpressionsänderungen in Krankheitsmodellen ermöglichen.

Warum sind Replikationsanforderungen bei der Mikrosphären-PCR in der interdisziplinären Zusammenarbeit wichtig?

Die reproduzierbare Sammlung des Überstandes nach der Amplifikation gewährleistet eine konsistente Ausbeute an einfachsträngiger DNA und ermöglicht einen zuverlässigen Datenaustausch zwischen Entdeckungs-, Assay-Entwicklungs- und präklinischen Teams.

Welche statistische Analyse ist erforderlich, bevor die Mikrosphären-PCR in einer Entdeckungspipeline implementiert wird?

Die Durchführung erfordert die Validierung der Amplifikationseffizienz und Produktreinheit anhand von Wiederholungsexperimenten sowie den statistischen Vergleich von Einzelstrang- mit Doppelstrang-DNA-Banden, um die Spezifität zu bestätigen.

Mikrosphären-Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation einzelsträngiger DNA

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Techniken

0 Ansichten • 3:02 Min. • July 8th, 2025

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Bei der Mikrosphären-PCR wird eine mikrogroße Kugel verwendet, die an Oligonukleotide auf ihrer Oberfläche gekoppelt ist, was die bevorzugte Amplifikation von einzelsträngiger DNA ermöglicht.

Um mit der Mikrosphären-PCR zu beginnen, nehmen Sie einen Reaktionsmix, der einzelsträngige DNA-Stränge enthält, Forward-Primer mit einem zusätzlichen Nukleotid-Tag, thermostabile DNA-Polymerase, dNTPs und Mikrosphären mit einzelsträngigen Oligonukleotidsonden.

Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler und lassen Sie es unter den definierten Bedingungen laufen.

Im ersten Zyklus, bei der Annealing-Temperatur, bindet die Matrizen-DNA an die Sonde auf der Oberfläche der Mikrosphäre, so dass die Matrizen-DNA als Sinnesstrang fungiert. Während der Verlängerung verlängert die Polymerase die DNA, und der Duplex bleibt an die Mikrosphäre gebunden.

Im nächsten Zyklus, während der Denaturierung, trennt sich die Matrizen-DNA von der Mikrosphäre, so dass der Sondenstrang an die Oberfläche gebunden bleibt – und als Matrize für einen neuen Strang dient.

Während des Glühens bindet der markierte Primer an den Antisense-Strang. Später verlängert die Polymerase es, um den Sinnesstrang mit dem Nukleotid-Tag zu synthetisieren.

Wiederholen Sie den Zyklus mehrmals, um mehrere Kopien der einzelsträngigen DNA zu erzeugen, die in die Lösung gelangen, während die doppelsträngigen Verunreinigungen gebunden bleiben.

Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein Röhrchen mit einem Ladepuffer. Laden Sie das Produkt und die Marker in verschiedene Vertiefungen des Gels und trennen Sie es mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese.

Die Template-DNAs bilden eine schwache Bande mit niedrigem Molekulargewicht, während eine intensive Bande mit hohem Molekulargewicht die Amplifikation einzelsträngiger DNA bestätigt.

Gewinnen Sie ca. 25 Mikrosphären durch mikroskopische Zählung mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher Vergrößerung. Kombinieren Sie anschließend alle Reagenzien wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die Proben in einen Thermocycler und starten Sie die asymmetrische PCR unter den entsprechenden Bedingungen.

Die Entnahme von Überständen nach einer symmetrischen PCR ist einer der wichtigsten Schritte, da es sich um einen wichtigen Prozess zur Erzeugung von Einzelstrang-DNA mit Mikrosphären handelt.

Nach der Amplifikation fügen Sie jeder Probe acht Mikroliter 6X-Ladepuffer hinzu. Laden Sie 15 Mikroliter jeder Probe in 2 % Agarosegel. Führen Sie dann eine Elektrophorese bei 100 Volt für 35 Minuten in 1X TAE-Puffer durch.