JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:09 Min. • July 8th, 2025
Die hochauflösende Schmelzpolymerase-Kettenreaktion, HRM-PCR, detektiert doppelsträngige DNA- und dsDNA-Sequenzvariationen mit hoher Präzision.
Beginnen Sie mit einem Mastermix, der inaktive Taq-Polymerase, Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) und den fluoreszierenden Reporterfarbstoff enthält. Fügen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer hinzu. Pipettieren Sie die Mischung in die Vertiefungen einer PCR-Platte.
Fügen Sie die dsDNA-Vorlage hinzu. Versiegeln Sie die Platte, um die Verdunstung der Mischung zu verhindern. Beginnen Sie mit der PCR.
Die hohe Denaturierungstemperatur denaturiert dsDNA zu einzelsträngiger DNA, ssDNA, und aktiviert die Polymerase. Die Reaktion wird dann auf die Annealing-Temperatur abgekühlt, was die Vorwärts- und Rückwärtsbindung des Primers an ssDNAs durch ortsspezifische komplementäre Basenpaarung erleichtert.
Die aktivierte Polymerase wird rekrutiert, wobei der DNA-Primer-Duplex durch dNTP-Zugabe erweitert wird.
Der fluoreszierende Reporterfarbstoff – ein dsDNA-spezifischer Farbstoff, der in sättigenden Konzentrationen vorliegt – interkaliert innerhalb des gesamten Duplex und fluoresziert hell. Der Duplex durchläuft mehrere PCR-Zyklen, wobei mehrere v
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