Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis der DNA-Methylierung in Leukozyten

Die Methylierung von DNA-Cytosin-Resten ist ein charakteristisches Merkmal von Leukozyten oder weißen Blutkörperchen.

Die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (mdPCR) ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung mehrerer methylierter DNA-Regionen innerhalb der Leukozyten.

Bereiten Sie eine Mischung vor, die Reaktionspuffer, DNA-Polymerase und nukleasefreies Wasser enthält. Fügen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie Fluoreszenzhydrolysesonden hinzu, die für jede Zielregion spezifisch sind. Die Sonden bestehen aus verschiedenfarbigen Fluorophor-Reportern, die an Quencher gebunden sind, um die Fluoreszenzemission zu hemmen.

Fügen Sie Bisulfit-konvertierte DNA hinzu, wobei die unmethylierten Cytosine in Uracile desaminiert werden, während die methylierten Cytosine unverändert bleiben. Mischen.

Füllen Sie eine Glasspritze mit einem Trägeröl-Tensid-Gemisch und eine weitere mit einem Trägeröl-PCR-Gemisch und verbinden Sie diese mit dem mikrofluidischen Tröpfchengenerator. Das Trägeröl-wässrige PCR-Gemisch emulgiert in Tröpfchen im Sub-Nanoliter-Bereich. Das Tensid stabilisiert die Emulsion und verhindert das Verschmelzen von Tröpfchen.

Sammeln Sie die Tröpfchen und führen Sie die PCR durch. In jedem Tröpfchen denaturiert die hohe Denaturierungstemperatur doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA und aktiviert die Polymerase. Die Reaktionstemperatur wird abgesenkt, was ein ortsspezifisches Glühen der Primer und Sonden ermöglicht.

Da die Polymerase den DNA-Primer-Duplex bindet und verlängert, amplifizieren Uracile als Thymine, während methylierte Cytosine als Cytosine amplifizieren, was die Unterscheidung zwischen methylierten und unmethylierten Regionen ermöglicht. Die Polymerase spaltet weiter und gibt den Reporter von der Sonde ab, wodurch eine Fluoreszenzemission verursacht wird.

Visualisieren Sie die Tropfen nach der PCR unter einem Mikroskop. Die Fluoreszenzfarbe zeigt das Vorhandensein spezifischer methylierter DNA-Ziele an.

Für die Tröpfchenerzeugung mischen Sie 1 Mikroliter Bisulfit-umgewandelte DNA mit frisch zubereiteter Sonden-Mastermischung in einem PCR-Röhrchen und entnehmen Sie die Probe mit einer kurzen Zentrifugation. Verwenden Sie PEEK-Fittings, um Einweg-Fluidikschläuche mit zwei Präzisionsglasspritzen mit einem Volumen von 250 Mikrolitern zu verbinden, und füllen Sie eine Präzisionsglasspritze mit 250 Mikrolitern Trägeröl mit 5 % Fluortensid und eine Präzisionsglasspritze mit 50 Mikrolitern Trägeröl vor.

Wenn beide Spritzen geladen sind, laden Sie 100 Mikroliter des PCR-Mixes in die Spritze mit dem Trägeröl und platzieren Sie ein mikrofluidisches Tröpfchengerät auf dem Tisch eines aufrechten Lichtmikroskops, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera ausgestattet ist.

Zur Beobachtung und Aufzeichnung der Tröpfchenbildung in Echtzeit legen Sie die vorgefüllten Spritzen auf eine programmierbare Spritzenpumpe und verwenden Sie eine PEEK-Verbindung mit Anschlüssen, um den Schlauch der Spritzen mit dem Schlauch der jeweiligen Einlasskanäle des mikrofluidischen Tröpfchengeräts zu verbinden.

Platzieren Sie den Schlauch vom Auslass des Tröpfchengenerators an der Innenseite eines 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchens und stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 2 Mikroliter pro Minute ein. Lassen Sie die Tröpfchengröße stabilisieren, bevor Sie die resultierende Emulsion sammeln. Sammeln Sie die Emulsion langsam und vorsichtig von der Oberseite des Röhrchens und geben Sie 75 Mikroliter der Lösung in ein 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen für den thermischen Zyklus.

Vergewissern Sie sich dann, dass der Ölgehalt im PCR-Röhrchen genau mit dem Volumen der dispergierten Phase übereinstimmt, um ein Verschmelzen der Tröpfchen während des thermischen Zyklus zu verhindern, und setzen Sie das 200-Mikroliter-Röhrchen in den Thermocycler ein.