Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

Die

digitale Polymerase-Kettenreaktion – oder dPCR – ist nützlich für die Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten – oder SNVs – einer Mutation, bei der die Substitution eines einzelnen Nukleotids an einer bestimmten Position im Genom zwei Nukleotidvariationen oder Allele erzeugt.

Um mit der Quantifizierung mit der Chip-in-a-Tube-dPCR-Technik zu beginnen, entnehmen Sie eine DNA-Probe, die SNVs enthält – das mutierte Allel und das entsprechende Wildtyp-Allel. Fügen Sie eine Mischung hinzu, die ein thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym, dNTPs und Primer enthält.

Fügen Sie als Nächstes allelspezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit Reportern verschiedenfarbiger Fluoreszenz markiert sind, um zwischen den Allelen zu unterscheiden, und ein Quenchermolekül. Die Nähe des Quenchers zum Reporter unterdrückt dessen Fluoreszenz.

Partitionieren Sie die Lösung in die Reaktionskammern eines mikrofluidischen Chips. Jede Kammer, die ein Allel enthält, dient als unabhängiges Reaktionsgefäß.

Legen Sie das Rohr mit dem Chip in einen Thermocycler und starten Sie die Reaktion. Bei hoher Temperatur denaturiert die doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen. Senken Sie die Temperatur, um die Primer und