Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

digitale Polymerase-Kettenreaktion – oder dPCR – ist nützlich für die Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten – oder SNVs – einer Mutation, bei der die Substitution eines einzelnen Nukleotids an einer bestimmten Position im Genom zwei Nukleotidvariationen oder Allele erzeugt.

Um mit der Quantifizierung mit der Chip-in-a-Tube-dPCR-Technik zu beginnen, entnehmen Sie eine DNA-Probe, die SNVs enthält – das mutierte Allel und das entsprechende Wildtyp-Allel. Fügen Sie eine Mischung hinzu, die ein thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym, dNTPs und Primer enthält.

Fügen Sie als Nächstes allelspezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit Reportern verschiedenfarbiger Fluoreszenz markiert sind, um zwischen den Allelen zu unterscheiden, und ein Quenchermolekül. Die Nähe des Quenchers zum Reporter unterdrückt dessen Fluoreszenz.

Partitionieren Sie die Lösung in die Reaktionskammern eines mikrofluidischen Chips. Jede Kammer, die ein Allel enthält, dient als unabhängiges Reaktionsgefäß.

Legen Sie das Rohr mit dem Chip in einen Thermocycler und starten Sie die Reaktion. Bei hoher Temperatur denaturiert die doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen. Senken Sie die Temperatur, um die Primer und Oligonukleotidsonden in ihre komplementären Bereiche zu glühen.

Bei einer geeigneten Verlängerungstemperatur dehnt die DNA-Polymerase die Primer aus und spaltet die Sonde. Die Entfernung zum Quencher ermöglicht die Fluoreszenzemission des Reporters.

Lesen Sie die verschiedenfarbigen Fluoreszenzsignale und erstellen Sie ein Positionsdiagramm, um die Kammern mit den Allelen zu erkennen.

Um die Häufigkeit des mutierten Allels – die Variantenallelfraktion – zu bestimmen, berechnen Sie das Verhältnis der Kammern, die das mutierte Allel enthalten, zum Wildtyp-Allel.

Fügen Sie zuvor entwickelte Primer, Sonden und genomische DNA zu einem neuen 8-Röhrchen-Streifen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 Mikrolitern zu erreichen. Pipettieren Sie zum Mischen auf und ab.

Legen Sie die Ladeplattform auf die Chips, die in den frischen 8-Rohr-Streifen eingebaut sind, und legen Sie den Rohrstreifen dann in den Auto-Loader. Stellen Sie sicher, dass ein Kontakt zwischen den Spänen und der Ladefläche besteht. Platzieren Sie als Nächstes den Ladeschieber in der Plattform und halten Sie den Schieber mit einem Stopper vom Lader fern. Pipettieren Sie 15 Mikroliter der PCR-Mischung in der Nähe der Spitze des Schiebers und drücken Sie dann die Ladetaste, um den Lader 1 Minute lang laufen zu lassen.

Entfernen Sie den Rohrstreifen nach dem Lauf aus dem Lader und legen Sie ihn in den Dichtverstärker. Drücken Sie vorsichtig auf den Schiebedeckel und den Rand des oberen Deckels. Lassen Sie den Dichtungsverstärker ca. 2 Minuten lang laufen. Wenn die Versiegelung unvollständig ist, was durch eine Flüssigkeitspfütze angezeigt wird, wiederholen Sie den Lauf für eine weitere Minute.

Geben Sie 230 Mikroliter Dichtungsflüssigkeit in die Rohre. Legen Sie den Röhrchenstreifen in den Thermocycler und führen Sie die PCR wie im Protokoll beschrieben durch. Wenn es eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen gibt, passen Sie die Temperatur oder die Dauer der PCR an.

Um die Fluoreszenzintensität der PCR-Produkte zu detektieren und zu analysieren, legen Sie den Röhrchenstreifen auf die Detektionsvorrichtung und fügen Sie 6 Milliliter destilliertes Wasser hinzu. Entfernen Sie sichtbare Luftblasen mit einer Pipettenspitze.

Laden Sie die Vorrichtung in den Detektor. Wählen Sie in der Detektionssoftware die Registerkarten "Fluoreszenz", "Experiment" und dann "Probe/NTC" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", um den Lauf zu starten. Bestätigen Sie nach dem vollständigen Lauf das Positionsdiagramm, das Histogramm und das 2D-Streudiagramm.

Um das PCR-Produkt zu sammeln, entfernen Sie die Dichtungsflüssigkeit aus dem Röhrchen. Fügen Sie 100 Mikroliter TE-Puffer hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang kräftig vortexen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz in einer Tischzentrifuge und gehen Sie wie im Textprotokoll beschrieben vor, um die Entnahme des PCR-Produkts abzuschließen.