Zellaggregationsassay zum Nachweis von Trans-Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen

Im Nervensystem bilden transzelluläre Wechselwirkungen – Wechselwirkungen zwischen spezifischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen, Transmembranproteinen, auf präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen – einen Komplex an den Synapsen, der die transsynaptische Signalübertragung vermittelt.

Um transzelluläre Wechselwirkungen zwischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen, die auf menschlichen embryonalen Nierenzellen exprimiert werden, über einen Zellaggregationsassay nachzuweisen, beginnen Sie mit transfizierten Zellsuspensionen.

Eine transfizierte Zellpopulation exprimiert das gewünschte präsynaptische Zelladhäsionsmolekül und das grün fluoreszierende Protein, die andere das spezifische postsynaptische Zelladhäsionsmolekül und das rot fluoreszierende Protein. Es werden auch zwei Zellpopulationen erhalten, die grün und rot fluoreszierende Proteine exprimieren.

Zentrifugieren Sie die Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen in geeigneten Medien, die mit Kalziumionen ergänzt sind. Mischen Sie die transfizierten Zellen beider Populationen gleichmäßig in einem Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Zellpopulationen.

Während der Inkubation binden die Kalziumionen an eine bestimmte Stelle auf dem präsynaptischen Protein, das in einer Zellpopulation exprimiert wird. Dies erhöht die Interaktion des präsynaptischen Proteins mit dem postsynaptischen Liganden der anderen Zellpopulation, was die Bindung erleichtert, die heterophile Zelladhäsion zwischen diesen Zellen vermittelt und zur Zellaggregation führt.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop bilden Sie die Zellen mit geeigneten Kanälen ab und visualisieren die grüne und rote Fluoreszenz der Zellen. Verarbeiten Sie die Bilder.

In den Zellpopulationen, die nur die fluoreszierenden Proteine exprimieren, ist keine Aggregation zu beobachten. Die Zellaggregation wird aufgrund der Überlappung zwischen den grün und rot fluoreszierenden Zellen, die die synaptischen Zelladhäsionsmoleküle exprimieren, als gelb dargestellt, was auf transzelluläre Wechselwirkungen zwischen den Molekülen hindeutet.

48 Stunden nach der Transfektion der HEK293T Zellen ernten Sie die Zellen aus der 6-Well-Platte zur Aggregation. Zuerst waschen Sie jedes Mal gut mit PBS. Um die Zellen vorsichtig zu trennen, geben Sie 1 Milliliter 10-Millimolar-EDTA in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte dann bei 37 Grad Celsius.

Nach fünf Minuten Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, und ernten Sie jede Vertiefung in ein separates konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die Röhrchen bei 500 x g bei Raumtemperatur 5 Minuten zentrifugieren.

Während die Zellen pelletieren, bereiten Sie sechs Inkubationsröhrchen vor, indem Sie die Oberseiten der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Versuchsbedingungen beschriften. Jede Permutation von GFP und mCherry sollte verwendet werden.

Entfernen Sie die Überstände aus den konischen 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Medium. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellen in jedem konischen Röhrchen. Dann aliquotieren Sie 200.000 Zellen aus jeder Bedingung in das entsprechende Inkubationsröhrchen für eine Eins-zu-Eins-Mischung mit einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern. Legen Sie die Inkubationsröhrchen bei Raumtemperatur in einen langsamen Röhrchenrotator.

Um die Aggregation zu beurteilen, pipettieren Sie zu Studienbeginn und erneut nach 60 Minuten 40 Mikroliter aus dem Inkubationsröhrchen auf einen geladenen Objektträger. Die Baseline-Erfassung sollte so schnell wie möglich nach der Zugabe von Zellen in das Mikrozentrifugenröhrchen erfolgen.

Stellen Sie den Objektträger unter Fluoreszenz sowohl im grünen als auch im roten Kanal dar. Nehmen Sie für jede Folie Bilder von drei verschiedenen Sichtfeldern in einer Fokusebene auf.