Proteinverdau auf der Membran zur Vorbereitung von co-immunpräzipitierten Proteinen für Interaktionsstudien

Um einen Verdau auf der Membran durchzuführen, nehmen Sie eine Lösung aus co-immunpräzipitierten Proteinkomplexen, die jeweils ein rekombinantes GFP-markiertes Zielprotein enthalten, das mit seinem Partnerprotein assoziiert ist.

Übertragen Sie die Proteine in ein Röhrchen, das eine vornasse Polyvinylidendifluorid- und PVDF-Membran enthält, und inkubieren Sie. Die hydrophile Oberfläche der PVDF-Membran hilft dabei, die Proteine auf die Membran zu übertragen.

Übertragen Sie die proteinhaltige Membran in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie einen Reduktionsmittel-haltigen Puffer hinzu, um die Disulfidbindungen zwischen den Cysteinresten zu reduzieren, was zu einer Denaturierung der einzelnen Proteine in den Komplexen führt, ohne deren Zusammenspiel zu stören.

Ersetzen Sie diese Lösung durch ein alkylierendes Reagenz, das die Sulfhydrylgruppe beider Proteine in den Komplexen alkyliert und die Neubildung von Disulfidbindungen verhindert. Waschen Sie die Membran, um überschüssiges Reagenz zu entfernen.

Behandeln Sie die Membran mit einem Puffer, der Trypsin enthält – ein proteolytisches Enzym. Trypsin spaltet das GFP-markierte Zielprotein und sein Partnerprotein am Carboxyl-Terminal der Argi