Proteinverdau auf der Membran zur Vorbereitung von co-immunpräzipitierten Proteinen für Interaktionsstudien

Um einen Verdau auf der Membran durchzuführen, nehmen Sie eine Lösung aus co-immunpräzipitierten Proteinkomplexen, die jeweils ein rekombinantes GFP-markiertes Zielprotein enthalten, das mit seinem Partnerprotein assoziiert ist.

Übertragen Sie die Proteine in ein Röhrchen, das eine vornasse Polyvinylidendifluorid- und PVDF-Membran enthält, und inkubieren Sie. Die hydrophile Oberfläche der PVDF-Membran hilft dabei, die Proteine auf die Membran zu übertragen.

Übertragen Sie die proteinhaltige Membran in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie einen Reduktionsmittel-haltigen Puffer hinzu, um die Disulfidbindungen zwischen den Cysteinresten zu reduzieren, was zu einer Denaturierung der einzelnen Proteine in den Komplexen führt, ohne deren Zusammenspiel zu stören.

Ersetzen Sie diese Lösung durch ein alkylierendes Reagenz, das die Sulfhydrylgruppe beider Proteine in den Komplexen alkyliert und die Neubildung von Disulfidbindungen verhindert. Waschen Sie die Membran, um überschüssiges Reagenz zu entfernen.

Behandeln Sie die Membran mit einem Puffer, der Trypsin enthält – ein proteolytisches Enzym. Trypsin spaltet das GFP-markierte Zielprotein und sein Partnerprotein am Carboxyl-Terminal der Arginin- und Lysinreste und gibt die kleineren Peptide an den Überstand ab. Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen.

Waschen Sie die Membran mit einer sauren Lösung, indem Sie alle gebundenen Peptide von der Membran trennen und eine vollständige Extraktion gewährleisten. Ziehen Sie die peptidhaltigen Fraktionen in ein einziges Röhrchen. Trocknen Sie durch Vakuumtrocknung aus.

Resuspendieren Sie die Rückstände in einer niedrigen Konzentration von Ameisensäure und lösen Sie die Peptide auf, die für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bereit sind.

Um die Membran vorzubereiten, schneiden Sie die PVDF-Membranen mit einer chirurgischen Schere, die unmittelbar vor der Verwendung gereinigt wurde, in 3 Millimeter x 3 Millimeter große Stücke. Legen Sie die Membranstücke auf Aluminiumfolie und fügen Sie jedem Stück 2 bis 5 Mikroliter Ethanol hinzu. Bevor die Membranen vollständig getrocknet sind, fügen Sie jedem Stück 2 bis 5 Mikroliter des Proteineluants hinzu und trocknen Sie sie an der Luft, bis die Membranoberfläche matt wird.

Übertragen Sie dann die Membranen in 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 Grad Celsius. Bei sofortiger Anwendung fügen Sie 2 bis 30 Mikroliter Ethanol hinzu, wodurch sie hydrophil werden. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Pipette. Bevor die Membranen jedoch trocknen, geben Sie 200 Mikroliter DTT-basierte Reaktionslösung vollständig in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 56 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Reaktionslösung durch 300 Mikroliter Jodacetamidlösung ersetzen und 45 Minuten im Dunkeln inkubieren. Waschen Sie dann die Membranen zweimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 2 % Acetonitril, indem Sie sie mindestens 10 Sekunden lang vortexen.

Die Arbeit mit Dithiothreitol und Acetonitril kann äußerst gefährlich sein. Eine Maske, eine Brille und Handschuhe sollten immer getragen werden, wenn der Aufschluss auf der Membran durchgeführt wird.

Bereiten Sie Trypsin gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor und fügen Sie jeder Membran 100 Mikroliter Trypsin-Reaktionslösung hinzu. Über Nacht bei 37 Grad Celsius zur Verdauung inkubieren.

Füllen Sie die Reaktionslösung am nächsten Tag in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen um und geben Sie 100 Mikroliter gewaschene Lösungen in die Membran. Inkubieren Sie die Membran zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius.

Sammeln Sie dann die gewaschene Lösung und mischen Sie sie mit der Reaktionslösung. Geben Sie weitere 100 Mikroliter gewaschene Lösung in die Membran und beschallen Sie sie 10 Minuten lang. Sammeln Sie dann die gewaschene Lösung und mischen Sie sie mit der Reaktionslösung. Decken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie ab und stechen Sie mit einer Nadel kleine Löcher in die Folie.

Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator und lösen Sie den Rückstand in 10 Mikrolitern 0,2%iger Ameisensäure auf. Das Röhrchen wird drei Minuten lang bei 12.000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein Probenröhrchen überführt.

Analysieren Sie die Probe mit einem Massenspektrometer, das mit einem Nano-LC-HPLC-System verbunden ist.