JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 5:20 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie für den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay eine gentechnisch veränderte, aktiv wachsende Hefezellsuspension, der das Transkriptionsaktivatorprotein GAL4 fehlt. Diese Zellen können Leucin und Tryptophan nicht synthetisieren.
Fügen Sie ein Paar Expressionsplasmide hinzu: eines kodiert für Leucin und die DNA-Bindungsdomäne DNA-BD von GAL4, die mit einer Zielproteindomäne fusioniert ist, und das andere, das für Tryptophan und die Aktivatordomäne AD von GAL4 kodiert und mit einer anderen Domäne des Zielproteins fusioniert ist.
Fügen Sie einen Puffer hinzu, der geeignete Agenten für die Transformation enthält. Versetzen Sie die Zellen durch einen Hitzeschock, um eine vorübergehende Porenbildung zu verursachen und die Aufnahme von zellulären Plasmiden zu erleichtern. Abkühlen lassen, um die Poren wieder zu verschließen. Plattieren Sie die Zellen auf einem selektiven Wachstumsmedium ohne Leucin und Tryptophan.
Die transformierten Zellen, die zwei Hybridproteine exprimieren, synthetisieren Leucin und Tryptophan, überleben und bilden Kolonien.
Das DNA-BD, das mit einer Proteindomäne fusioniert ist, bindet an die spezifische vorgeschaltete DNA-Sequenz der β-Galactosidase-kodierenden Genpromoto
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