Kernspinresonanz zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ermöglicht die Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene.

Um Wechselwirkungen zwischen globulären und helikalen Proteinen zu untersuchen, markieren gereinigte Wildtyp- oder mutierte globuläre Proteine mit ¹⁵N – einem Stickstoffisotop. Mischen Sie in einem NMR-Röhrchen die markierten globulären und unmarkierten helikalen Proteine in einem Lösungsmittel, das einen NMR-Standard enthält. Führen Sie den Schlauch in das NMR-Spektrometer ein.

Die Spektrometermagnete erzeugen ein starkes Magnetfeld, das die ¹⁵N-markierten globulären Proteinkerne parallel zum Feld ausrichtet. Ein Hochfrequenz- oder HF-Impuls regt die ¹⁵N-Kerne an, sich antiparallel zum Feld auszurichten.

Die Pulsfrequenz, die für den Übergang von ¹⁵N Kernen zwischen den beiden Zuständen benötigt wird, definiert die Resonanzfrequenz. Die Normalisierung der ¹⁵N-Resonanzfrequenz auf den NMR-Standard misst die chemische Verschiebung ^{von 15}N.

Das Magnetfeld wird so eingestellt, dass die ¹H-Kerne – gebunden an ¹⁵N – parallel zum Feld ausgerichtet sind. Die HF-Impulse werden angepasst und die chemische Verschiebung ^{von 1}H wird aufgezeichnet.

Während Proteininteraktionen ändert sich die chemische Umgebung, die die interagierenden Aminosäurereste umgibt, wodurch sich die chemischen ^{15 N-1}H-Bindungen und die entsprechenden chemischen Verschiebungen verändern. Plotten Sie die ^{15 N-1}H NMR-Spektren.

Ohne helikale Proteine weisen kugelförmige Wildtyp-Proteine gut aufgelöste spektrale Peaks auf. Wenn helikale und wildartige globuläre Proteine interagieren, wird der spektrale Peak reduziert. Im Gegensatz dazu führt die Inkubation von helikalen Proteinen mit mutierten globulären Proteinen dazu, dass die spektralen Peaks wieder auftauchen, was auf keine Wechselwirkung zwischen ihnen hinweist.

Schalten Sie den Luftstrom mit dem Auswurfbefehl "ej" ein. Dadurch wird die Probe vom Magneten nach oben gebracht. Legen Sie nun die Probe in einen Spinner auf den Magneten in der Öffnung. Einfügen mit dem Befehl "ij". Warten Sie, bis sich die Probe im Magneten abgesetzt hat, bevor Sie fortfahren.

Erstellen Sie einen neuen Datensatz mit dem Befehl "edc" und laden Sie die Standard-Protonen-NMR-Parameter, indem Sie das Experiment "ZGPR" auswählen. Füllen Sie die Felder Name, Experimentnummer und Nummer des verarbeiteten Datenordners aus.

Wählen Sie das Lösungsmittel im Feld "Lösungsmittel einstellen" aus und klicken Sie auf "'getprosol' ausführen", um den Standard-Sondenkopf und die lösungsmittelabhängigen Parameter abzulesen. Sperren Sie die Probe mit dem Befehl "Lock" an das deuterierte Lösungsmittel und warten Sie, bis der Sweep abgeschlossen ist und die Verriegelung erreicht ist.

Korrigieren Sie die Resonanzfrequenz des Magneten, indem Sie das Sample mit dem automatischen Abstimmbefehl "atma" abstimmen. Überwachen Sie die Wobble-Kurve, bis die automatische Abstimmung abgeschlossen ist.

Scheiben Sie das Magnetfeld mit "TOPSHIM" ab. Das Shimming passt das Magnetfeld an, um eine Gleichmäßigkeit um die Probe herum zu erreichen. Es empfiehlt sich, die gleichen Werte mit dem Befehl "wsh" zu speichern und sie mit "rsh" vor topshim zu lesen, wenn die gleichen oder ähnliche Beispiele verwendet werden.

Passen Sie nun die Empfängerverstärkung mit dem Befehl "rga" an, um das maximale Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Platzieren Sie die Mitte des Spektrums auf dem Wasserresonanzversatz und stellen Sie den 90-Grad-Protonenpuls mit "calibo1p1" auf hohe Leistung ein.

Sammeln Sie das Protonenspektrum mit dem Zero Go "zg"-Befehl und verarbeiten Sie es mit "efp". Dazu gehören die exponentielle Multiplikation, der freie Induktionszerfall mit Linienverbreiterung, die Fourier-Transformation von FID und "pk" zur Anwendung der Phasenkorrektur.

Wenden Sie die automatische Phasenkorrektur "apk" und die automatische Basislinienkorrektur "absn" mit der Option Polynom ohne Integration an. Erstellen Sie einen neuen Datensatz für das SOFAST HMBC-Experiment, indem Sie im Experiment "SFHMQC3GPPH" auswählen.

Kopieren Sie die optimierten P1 und O1 aus dem Protonenspektrum und füllen Sie P1-abhängige Pulse mit dem Befehl "getprosol 1H p1 plw1", wobei P1 der optimierte P1-Wert und plw1 der Leistungspegel für P1 ist. Optimieren Sie nun die CNST54-Konstante, um den Offset für die chemische Amidverschiebung festzulegen. Optimieren Sie außerdem den CNST55, um die Bandbreite zu definieren, um die interessierenden Spektralbereiche zu erfassen, wodurch die Empfängerverstärkung optimiert werden kann.

Um diese Parameter auszuwählen, extrahieren Sie den ersten FID aus dem zweidimensionalen Spektrum und suchen Sie nach dem beobachteten Signal, um sie zu definieren. Variieren Sie außerdem die Relaxationsverzögerung, die Anzahl der Scans und die Dummy-Scans, um eine akzeptable Signalempfindlichkeit mit dem Befehl "gs" zu erhalten, der es Go und Scan ermöglicht, die Datenqualität in Echtzeit zu überwachen. Nehmen Sie abschließend die Spektren mit Zero Go "zg" auf.