Verwendung des Phagen-Displays zur Auswahl von Proteinen mit hoher Affinität zu einem Zielprotein

Beginnen Sie die Phagenpräsentation, indem Sie eine Phagenbibliothek in die Vertiefungen einer Multi-Well-Platte geben, die mit dem Zielprotein beschichtet ist. Die Phagenbibliothek enthält gentechnisch veränderte Phagen, die jeweils eine individuelle Proteinvariante aufweisen, die mit einem Hüllprotein auf ihrer Oberfläche fusioniert ist. Inkubieren, so dass der Phagen und die Zielproteine interagieren können.

Phagen mit Proteinen mit einer hohen Zielproteinaffinität binden an das Zielprotein. Mit einem Puffer waschen und ungebundene Phagen entfernen. Fügen Sie eine saure Lösung hinzu, die die Wechselwirkungen zwischen Phagen und Zielprotein unterbricht und Phagen in die Lösung freisetzt. Neutralisieren Sie den pH-Wert der Lösung mit einem Puffer, um die Phagenstabilität zu erhalten.

Übertragen Sie die Phagen in ein frisches Röhrchen. Inkubieren Sie mit einer Blockierungslösung, die Proteine enthält, um unspezifische Wechselwirkungen zu vermeiden.

Übertragen Sie die Phagen in eine sich aktiv teilende E. coli-Suspension, infizieren Sie die Bakterien und initiieren Sie den Phagen-Replikationszyklus. Ergänzung mit Helferphagen, die die Bakterien infizieren und die Hüllproteine liefern, die für die Verpackung der Nachkommenphagen erforderlich sind. Übertragen Sie die Suspension in ein selektives Medium, wodurch das Wachstum von Phagen-infizierten Bakterien ermöglicht wird.

Die Nachkommenphagen werden schließlich in das Medium entlassen. Zentrifuge. Sammeln Sie den Überstand, der Phagen enthält. Fügen Sie eine Fällungslösung hinzu und konzentrieren Sie die Phagenpartikel. Zentrifuge. Das Phagenpellet wird in einem Puffer resuspendiert, um eine homogene Suspension zu erhalten.

Führen Sie nachfolgende Phagen-Selektionsrunden durch; wiederholen Sie die Phagen-Zielprotein-Bindung, die Elution mit einem erhöhten Pufferwasch-Stringenzschritt sowie die Amplifikations- und Zentrifugationsschritte, was zur Anreicherung von Phagenpools führt, die Proteine mit hoher Affinität zum Zielprotein aufweisen.

Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf. Verdünnen Sie es dann auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS. Die Polyethylenglykol/Natriumchlorid-Lösung wird in 1/5 des verdünnten Bibliotheksvolumens zugegeben und die Lösung 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 11.000 mal g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn weitere zwei Minuten lang, um den restlichen Überstand abzuziehen und das Phagenpellet zu konzentrieren.

Das Phagenpellet wird vorsichtig in einem Milliliter PBT-Puffer pro zu analysierendem Zielprotein resuspendiert, in der Regel insgesamt vier. Geben Sie 100 Mikroliter Phagenbibliothek in jede beschichtete Vertiefung in der Kontrollplatte. Inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 300 U/min Orbitalschütteln.

Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte in die Spüle und trocknen Sie die Platte auf Küchenpapier ab. Übertragen Sie alle 100 Mikroliter der Phagenbibliothek in der Kontrollplatte in jede beschichtete Vertiefung der Zielplatte. Inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 300 U/min Orbitalschütteln.

Entfernen Sie anschließend die Phagenbibliothek von der Platte und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Tropfen Puffer zu entfernen. Geben Sie 100 Mikroliter 0,1 molare Salzsäure in jede beschichtete Vertiefung, um den Phagen zu eluieren. Inkubieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 U/min Orbitalschütteln.

Neutralisieren Sie danach den pH-Wert, indem Sie 12,5 Mikroliter pH 11 und ein molares Tris-Hydrochlorid in jede beschichtete Vertiefung geben. Übertragen Sie den eluierten Phagen aus allen acht Vertiefungen in ein einzelnes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie während des Transfers auf und ab, um die Lösungen homogen zu machen, und saugen Sie die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen an. Fügen Sie dem eluierten Phagen 10 % BSA hinzu, um die Endkonzentration auf 1 % zu erreichen.

Lagern Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius. Dies ist die Ausgabe der ersten Runde. Bereiten Sie eine Saatgutkultur für die Kultivierung des Phageneinsatzes für die nächste Selektionsrunde vor, indem Sie fünf Milliliter 2YT/Tetracyclin-Saatgutkultur mit einer isolierten E. coli-Kolonie aus einer Agarplatte inokulieren.

Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 U/min Orbitalschütteln. Verdünnen Sie das Zielprotein in den Röhrchen der zweiten und dritten Runde mit einer angemessenen Menge PBS. Nehmen Sie die Hälfte des Inhalts der Röhrchen der Runden zwei und drei und beschichten Sie vier Vertiefungen pro Zielprotein mit einer 96-Well-Bindungsplatte für die nächste Runde.

Verwenden Sie als Nächstes die Hälfte des Ausgangs rund eins, um drei Milliliter Zellen in der mittleren logarithmischen Phase zu beimpfen. Inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min Orbitalschütteln. Geben Sie M13KO7 Helper Phage bis zu einer Endkonzentration von 10 Milliarden pfu pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie es erneut bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit 200 U/min Orbitalschütteln.

Nach einer Stunde werden die gesamten drei Milliliter der Kultur in 30 Milliliter 2YT/Carbenicillin/Kanamycin-Lösung überführt. Anbau über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min Orbitalschütteln.