Chromatin-Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zielprotein-Bindungsstellen auf genomischer DNA

Um die Bindungsstellen eines Zielproteins auf der DNA zu identifizieren, beginnen Sie mit Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die ein Zielprotein enthalten, das mit spezifischen DNA-Sequenzen im Chromatin vernetzt ist.

Behandeln Sie die Zellen mit einem Lysepuffer, der Proteasehemmer enthält. Der Lysepuffer lysiert die Zellen, während die Inhibitoren Proteasen inaktivieren, um die Integrität der Protein-Chromatin-Komplexe zu erhalten.

Beschallen Sie den Inhalt, um die Komplexe in kleinere Chromatinfragmente zu scheren, wobei einige das Zielprotein beibehalten.

Zentrifugieren Sie, um die Zellkomponenten zu pelletieren, und überführen Sie den Überstand mit den Chromatinfragmenten in ein frisches Röhrchen. Inkubieren Sie mit Anti-Target-Antikörpern, die spezifisch an das Zielprotein auf den Chromatinfragmenten binden.

Ergänzen Sie das Röhrchen mit Protein-A-beschichteten magnetischen Kügelchen, die an die Fc-Region von vorgebundenen Antikörpern binden. Wenden Sie ein Magnetfeld an, um die antikörpergebundenen Zielproteine, die mit Chromatinfragmenten komplexiert sind, selektiv auszufällen.

Behandeln Sie die Kügelchenkomplexe mit einem hochsalzhaltigen Elutionspuffer, um die Protein-Chromatin-Wechselwirkungen zu unterbrechen und die nackte DNA ohne assoziierte Proteine freizusetzen.

Verwenden Sie organische Lösungsmittel, um die DNA zu extrahieren. Fügen Sie einen Amplifikationspuffer hinzu und führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion durch, um die DNA-Fragmente zu amplifizieren. Analysieren Sie nach der Amplifikation die DNA-Sequenz.

Vergleichen Sie die Sequenz der amplifizierten Produkte mit der genomischen DNA-Sequenz der Zelle. Finden Sie die Region mit einer Sequenzübereinstimmung zwischen dem Fragment und der genomischen DNA, die mit den Proteinbindungsstellen korreliert.

Nach der Zählung in einem Hämozytometer fügen Sie 20.000 gereinigte OPCs in 1 Milliliter OPC-Zellkulturmedium für die ChIP-Reaktion hinzu. Fügen Sie dann 27 Mikroliter 36,5 % Formaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten hinzu. Dadurch werden die Zellen fixiert.

Geben Sie nach 10 Minuten 50 Mikroliter 2,5 molares Glycin für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf die fixierten Zellen. Die Zugabe von Glycin stoppt die DNA-Protein-Vernetzung. Waschen Sie dann die vernetzten Zellen mit 1 Milliliter HBSS-Puffer mit Proteasehemmer-Cocktail. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen in einer vorgekühlten Zentrifugenmaschine bei 300 mal g bei 4 Grad Celsius.

Nach der Vernetzung der gereinigten OPCs sollten die vernetzten Zellen mit eiskalter HBSS-Lösung gewaschen werden, und die restlichen ChIP-Schritte sollten bei 4 Grad durchgeführt werden. Andernfalls kann der Antikörper die genomische DNA nicht richtig ausfällen.

Geben Sie dann 25 Mikroliter vollständigen Lysepuffer zum Zellpellet und lassen Sie es 5 Minuten lang auf Eis. Pipettieren Sie anschließend 75 Mikroliter eiskalten HBSS-Puffer mit Proteasehemmer-Cocktail. Scheren Sie dann das Chromatin des Zelllysats in einem vorgekühlten Beschallungssystem mit fünf Zyklen von 30 Sekunden EIN und 30 Sekunden AUS.

Sobald das Chromatin geschert ist, zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand aufgefangen. Verdünnen Sie dann 100 Mikroliter des gescherten Chromatins mit dem gleichen Volumen des eiskalten ChIP-Puffers mit Proteaseinhibitor.

Als nächstes fügen Sie 1 Mikroliter Kaninchen-Anti-Olig2-Antikörper zu 180 Mikrolitern des verdünnten gescherten Chromatins hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen auf einem rotierenden Rad 16 Stunden lang bei 4 Grad Celsius und 40 Umdrehungen pro Minute. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter vorgewaschene Protein A-beschichtete Kügelchen in das ChIP-Reaktionsröhrchen in einem Kühlraum. Auch hier werden die ChIP-Röhren bei 4 Grad Celsius für weitere 2 Stunden auf dem rotierenden Rad inkubiert.

Lassen Sie das ChIP-Reaktionsröhrchen nach 2 Stunden eine Minute lang auf dem Magnetgestell. Waschen Sie dann das Bead-Pellet mit 100 Mikrolitern zu je vier Waschpuffern 4 Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei 4 Grad Celsius. Geben Sie dann 200 Mikroliter Elutionspuffer zum Bead-Pellet. Inkubieren Sie das Reaktionsgefäß bei 65 Grad Celsius für 4 Stunden.

Sobald die doppelsträngige DNA denaturiert ist, wird das 3-Prime-Ende der Einzelstrang-DNA durch Zugabe von alkalischer Phosphatase der Garnele dephosphoryliert. Fügen Sie dann der einzelsträngigen DNA mit Hilfe der terminalen Desoxynukleotidyltransferase einen Poly(T)-Schwanz hinzu. Als nächstes annehen Sie den DNA-Poly-(dA)-Primer an das einzelsträngige DNA-Template. Amplifizieren Sie als Nächstes die ChIP-Sequenzbibliothek mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern für die Indizierung.

Die Anzahl der PCR-Zyklen für die Bibliotheksvorbereitung hängt von der Menge der Ausgangs-DNA ab. Eine gute Bibliotheksvorbereitung erfordert eine genaue Quantifizierung der eingegebenen DNA-Menge. Zu viele oder zu wenige PCR-Zyklen können sowohl die Bibliothekskonzentration als auch die Komplexität beeinflussen, was zu PCR-Artefakten führt.

Verwenden Sie paramagnetische Kügelchen, um die Fragmente im Bereich von 250 bis 500 Basenpaaren aus der PCR-amplifizierten ChIP-Sequenzbibliothek auszuwählen. Verwenden Sie ein mikrofluidisches ChIP-Kapillarelektrophoresegerät, um die Qualität der ausgewählten ChIP-Sequenzbibliothek zu untersuchen.