Reportergen-Repressionsassay zur Untersuchung der translationalen Regulation eines Zielgens

RNA-bindende Proteine, RBPs, fungieren als posttranskriptionelle Regulatoren, indem sie an die Translationsinitiationsregion (TIR) der mRNA binden und die Translation unterdrücken.

Um RNA-RBP-Wechselwirkungen durch translationale Repression eines Reportergens zu untersuchen, nehmen Sie eine bakterielle Zellkultur, die zwei Plasmide enthält – die Bindungsstelle und die RBP-Plasmide.

Das Plasmid an der Bindungsstelle kodiert für ein fluoreszierendes Reportergen. Nach der Transkription enthält das TIR der resultierenden mRNA eine Ribosomenbindungsstelle und eine Haarnadelstruktur mit einer Sequenz, die von RBPs erkannt wird.

Ribosomen binden an die Bindungsstelle auf der mRNA und destabilisieren die Haarnadelstruktur, was zur mRNA-Translation und zur Bildung fluoreszierender Reporterproteine führt. Das RBP-Plasmid exprimiert ein chimäres RBP, das mit einem anderen fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Ein induzierbarer Promotor steuert die chimäre Proteinexpression.

Fügen Sie den Induktor hinzu, der einen Transkriptionsfaktor aktiviert, der an den Promotor bindet und die chimäre Proteinexpression induziert. Das RBP des chimären Proteins bindet an die Haarnadelstruktur. Dadurch wird die Bindung des Ribosoms an die mRNA blockiert und die Translation des Reporterproteins gehemmt.

Mit zunehmender Induktorkonzentration steigt die RBP-Produktion, was zu einer stärkeren kompetitiven Hemmung der ribosomalen Bindung an die mRNA führt.

Messen Sie die verschiedenen Fluoreszenzsignale von den chimären und Reporterproteinen. Zeichnen Sie die Signale auf, um die Dosis-Wirkungs-Kurve zu erhalten.

Mit der Induktor-vermittelten Erhöhung der RBP-Produktion reduziert die translationale Repression die Konzentration des Reporterproteins, was die RNA-RBP-Interaktion bestätigt.

Transformieren Sie die präparierten Plasmide in chemisch kompetente Bakterienzellen, die bereits ein RBP-mCerulean-Plasmid enthalten. Um Zeit zu sparen, werden die Zellen mit einer 8-Kanal-Pipettiermaschine auf 8-Bahnen-Platten, die Luria-Bertani-Agar enthalten, mit relevanten Antibiotika beschichtet. Die Völker sollten in 16 Stunden bei 37 Grad Celsius erscheinen.

Wählen Sie für jeden Doppeltransformator eine einzelne Kolonie aus und übertragen Sie sie mit geeigneten Antibiotika auf 48-Well-Platten mit 1,5 Millilitern LB. Züchten Sie die Zellen über einen Zeitraum von 18 Stunden bei 37 Grad Celsius und Schütteln bei 250 U/min. Lagern Sie die Glycerinvorräte über Nacht bei -80 Grad Celsius in 96-Well-Platten.

Programmieren Sie den Roboter morgens so, dass er 180 Mikroliter Semi-Poor Medium (SPM) in 96-Well-Platten erwärmt. Programmieren Sie den Roboter so, dass er die Induktionsplatte vorbereitet.

Bereiten Sie in einer sauberen 96-Well-Platte Wells mit SPM vor, die aus 95 % BA und 5 % LB bestehen. Die Anzahl der Wells entspricht der gewünschten Anzahl an Induktorkonzentrationen. Geben Sie C4-HSL in die Vertiefungen in der Induktionsplatte, die die höchste Induktorkonzentration enthalten.

Als nächstes programmieren Sie den Roboter so, dass er das Medium aus jeder der Vertiefungen mit der höchsten Konzentration seriell in 23 niedrigere Konzentrationen von 0 bis 218 Nanomolar verdünnt. Das Volumen jeder Induktorverdünnung sollte für alle Stämme ausreichend sein.

Um die Übernachtstämme zu verdünnen, programmieren Sie den Roboter so, dass er um den Faktor 10 verdünnt, indem er 20 Mikroliter Bakterien mit 180 Mikrolitern SPM in 48-Well-Platten mischt. Dann erneut um den Faktor 10 verdünnen, indem 20 Mikroliter aus der verdünnten Lösung in die vorbereitete Dehnungsplatte gegeben werden, die für Fluoreszenzmessungen geeignet ist.

Programmieren Sie nun den Roboter so, dass er den verdünnten Induktor von der Induktorplatte zu den 96-Well-Platten mit den verdünnten Stämmen entsprechend den Endkonzentrationen hinzufügt. Schütteln Sie die 96-Well-Platten 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Während dieser Zeit messen Sie alle 30 Minuten die optische Dichte oder OD bei 595 Nanometern sowie die mCherry- und mCerulean-Fluoreszenz mit einem Plattenlesegerät.