Reportergen-Repressionsassay zur Untersuchung der translationalen Regulation eines Zielgens

RNA-bindende Proteine, RBPs, fungieren als posttranskriptionelle Regulatoren, indem sie an die Translationsinitiationsregion (TIR) der mRNA binden und die Translation unterdrücken.

Um RNA-RBP-Wechselwirkungen durch translationale Repression eines Reportergens zu untersuchen, nehmen Sie eine bakterielle Zellkultur, die zwei Plasmide enthält – die Bindungsstelle und die RBP-Plasmide.

Das Plasmid an der Bindungsstelle kodiert für ein fluoreszierendes Reportergen. Nach der Transkription enthält das TIR der resultierenden mRNA eine Ribosomenbindungsstelle und eine Haarnadelstruktur mit einer Sequenz, die von RBPs erkannt wird.

Ribosomen binden an die Bindungsstelle auf der mRNA und destabilisieren die Haarnadelstruktur, was zur mRNA-Translation und zur Bildung fluoreszierender Reporterproteine führt. Das RBP-Plasmid exprimiert ein chimäres RBP, das mit einem anderen fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Ein induzierbarer Promotor steuert die chimäre Proteinexpression.

Fügen Sie den Induktor hinzu, der einen Transkriptionsfaktor aktiviert, der an den Promotor bindet und die chimäre Proteinexpression induziert. Das RBP des chimären Proteins bindet an die Haarnadelstruktur. Dadurch wird