Messung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins mit Hilfe von Biotin-markierten RNA-Duplexen

Proteine mit RNA-Helikase-Aktivität können helfen, einzelne RNA-Moleküle in einem RNA-Duplex abzuwickeln und zu trennen.

Um die Helikase-Aktivität eines Proteins zu bestimmen, nehmen Sie Röhrchen, die eine Mischung aus Biotin-markierten RNA-Duplexen mit einem 5'-Überhang, ATPs und RNA-Fallen enthalten – unmarkierte Stränge, die zu den biotinylierten Strängen der Duplexe komplementär sind.

Geben Sie das Protein mit Helikase-Aktivität in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es unterschiedlich lange. Das Protein bindet an den 5'-Überhang der Doppelhäuser.

Mit Hilfe von ATP-Molekülen bricht es Wasserstoffbrückenbindungen zwischen zwei Duplexsträngen auf, was dazu führt, dass sie sich abwickeln und die biotinylierte einzelsträngige RNA freisetzen. Die RNA-Fallen interagieren mit den Biotin-markierten Strängen und verhindern so ein erneutes Anlüfen mit den getrennten Strängen.

Beenden Sie die Reaktion mit einem Terminierungspuffer.

Laden Sie die Proben in verschiedene Vertiefungen eines nativen Polyacrylamidgels. Führen Sie die Elektrophorese durch. Niedrigmolekulare, einzelsträngige RNA bewegt sich schneller als hochmolekulare Duplexe. Diese Mobilitätsverschiebung führt zu zwei unterschied