Messung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins mit Hilfe von Biotin-markierten RNA-Duplexen

Proteine mit RNA-Helikase-Aktivität können helfen, einzelne RNA-Moleküle in einem RNA-Duplex abzuwickeln und zu trennen.

Um die Helikase-Aktivität eines Proteins zu bestimmen, nehmen Sie Röhrchen, die eine Mischung aus Biotin-markierten RNA-Duplexen mit einem 5'-Überhang, ATPs und RNA-Fallen enthalten – unmarkierte Stränge, die zu den biotinylierten Strängen der Duplexe komplementär sind.

Geben Sie das Protein mit Helikase-Aktivität in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es unterschiedlich lange. Das Protein bindet an den 5'-Überhang der Doppelhäuser.

Mit Hilfe von ATP-Molekülen bricht es Wasserstoffbrückenbindungen zwischen zwei Duplexsträngen auf, was dazu führt, dass sie sich abwickeln und die biotinylierte einzelsträngige RNA freisetzen. Die RNA-Fallen interagieren mit den Biotin-markierten Strängen und verhindern so ein erneutes Anlüfen mit den getrennten Strängen.

Beenden Sie die Reaktion mit einem Terminierungspuffer.

Laden Sie die Proben in verschiedene Vertiefungen eines nativen Polyacrylamidgels. Führen Sie die Elektrophorese durch. Niedrigmolekulare, einzelsträngige RNA bewegt sich schneller als hochmolekulare Duplexe. Diese Mobilitätsverschiebung führt zu zwei unterschiedlichen Bändern.

Tupfen Sie das Gel auf eine Nylonmembran und übertragen Sie die RNAs auf die Membran. Setzen Sie die Membran nach dem Blotting UV-Licht aus und vernetzen Sie die RNAs mit der Membran.

Fügen Sie chemilumineszierendes Enzym-konjugiertes Streptavidin hinzu, das mit dem Biotin auf den Duplexen und einzelsträngigen Strängen interagiert. Verwenden Sie chemilumineszierende Substrate zur Herstellung von Chemilumineszenzprodukten.

Bei der Bildgebung nimmt die Intensität des niedermolekularen Bandes mit der Zeit zu und korreliert mit der Helikase-Aktivität des Zielproteins.

Für den MOV10-Helikase-Aktivitätsassay mischen Sie die Reagenzien gemäß den Anweisungen des Manuskripts und fügen Sie Wasser hinzu, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern zu erhalten. Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten, 30 Minuten und 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann 5X Stop Buffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Bereiten Sie dann ein 20%iges natives Polyacrylamid-Gel vor und laden Sie 20 bis 25 Mikroliter jeder Probe in jede Vertiefung. Lassen Sie das Gel bei 100 Volt in einem Eisbad laufen, bis der Bromphenolblau-Marker in das untere Viertel des Gels gewandert ist.

Acrylamid ist schädlich und giftig. Es ist wichtig, es mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung zu handhaben.

Zerlegen Sie die Gelplatten und trimmen Sie das Gel, indem Sie Ladevertiefungen und ungenutzte Fahrspuren entfernen. Geben Sie das Gel in 0,5X FSME-Puffer. Schneiden Sie das Filterpapier und die Nylonmembran auf die Größe des Gels zu, befeuchten Sie das Papier und die Membran vor und montieren Sie den Stapel für den Transfer.

Die Proben aus dem Gel werden in einer halbtrockenen elektrophoretischen Vorrichtung bei 90 Milliampere für 20 Minuten auf die Membran übertragen. Vernetzen Sie dann die Proben, indem Sie die Membran 45 bis 60 Sekunden lang mit 120 Millijoule pro Quadratzentimeter bestrahlen

.

Für den Chemilumineszenz-Nachweis beginnen Sie damit, der Membran 20 Milliliter Blockierungspuffer hinzuzufügen und sie 15 bis 30 Minuten lang unter leichtem Schütteln zu inkubieren. Entfernen Sie vorsichtig den Blockierungspuffer, und ersetzen Sie ihn durch einen konjugierten Blockierungspuffer. Inkubieren Sie die Membran erneut für 15 Minuten.

Waschen Sie die Membran viermal unter Schütteln für 5 Minuten pro Waschgang. Geben Sie dann 30 Milliliter Substratausgleichspuffer in die Membran und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang unter Schütteln bei 20 bis 25 U/min.

Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Membran mit Substratarbeitslösung und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang. Nach der Inkubation scannen Sie die Membran 1 bis 3 Sekunden lang in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem.