Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

Strahleninduzierte DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) initiieren die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen an der beschädigten Stelle – und aktivieren so die DNA-Reparatur.

Um die DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an DSB-Stellen mittels indirekter Immunfluoreszenz nachzuweisen, nehmen Sie Deckgläser mit Epithelzellen. Bestrahlen Sie eine Teilmenge der Zellen. Inkubieren, so dass die Kontrolle nicht bestrahlte und bestrahlte Zellen für bestimmte Zeiten wachsen kann.

Mit einem Puffer behandeln, um die Zellkerne zu extrahieren. Fixieren Sie die Zellkerne, um ihre Morphologie zu erhalten. Mit einer Blockierungslösung behandeln, um die unspezifische Bindung an Primärantikörper zu minimieren.

Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf die beiden DNA-Reparaturproteine abzielen. Die Antikörper binden an die jeweiligen Proteine.

Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern, die mit roten bzw. grünen Fluorophoren markiert sind. Die Sekundärantikörper – spezifisch für jeden Primärantikörper – binden an ihre Ziele. Fügen Sie ein Eindeckmedium mit DAPI auf einen Objektträger hinzu. Montieren Sie die Deckgläser für die Bildgebung.

DAPI – ein DNA-bindender Farbstoff – bindet an die AT-reichen Nebenrillen der doppelsträngigen DNA und färbt die Zellkerne gegen. Visualisieren Sie die Zellkerne mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Im Vergleich zu nicht bestrahlten Zellkernen weisen bestrahlte Zellkerne mehrere γH2AX-Herde auf, die mit der Zeit abnehmen, was auf eine fortschreitende DNA-Reparatur in Zellen hinweist, die über längere Zeiträume gewachsen sind.

Überlappende rote und grüne Fluoreszenzsignale erscheinen gelb, was auf die Kolokalisation von γH2AX und 53BP1 an der DSB-Stelle nach der Bestrahlung hinweist.

Beginnen Sie mit der Züchtung von 40.000 HeLa-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte mit einem runden 18-Millimeter-Glasdeckglas bis zu einer Konfluenz von 80 %. Nachdem Sie die Zellen 4 grauer Gammastrahlung ausgesetzt haben, waschen Sie sie zweimal mit 1 Milliliter PBS. Entfernen Sie dann das PBS vollständig und geben Sie 200 Mikroliter NEB in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, dann entfernen Sie die NEB.

Beachten Sie, dass die Inkubationszeit je nach Zelllinie variieren kann, aber im Allgemeinen zwei Minuten nicht überschreiten sollte. Waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS. Entfernen Sie dann das PBS vollständig und geben Sie 200 Mikroliter 4% PFA zur Zellfixierung in jede Vertiefung

Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius, entfernen Sie dann das PFA und geben Sie 1 Milliliter PBS in jede Vertiefung. Entfernen Sie PBS vollständig und geben Sie dann 200 Mikroliter Blockierungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 16 bis 18 Stunden bei 4 Grad Celsius.

Verdünnen Sie den Primärantikörper in einem Verdünnungspuffer und wirbeln Sie ihn, bis er gut vermischt ist. Kleben Sie ein Stück Parafilm in eine Feuchtigkeitsbox und fügen Sie 10 Mikroliter Primärantikörper in einem einzigen Tropfen hinzu. Richten Sie eine Kante des Deckglases aus der Vertiefung mit dem Tropfen aus und senken Sie es langsam auf den Parafilm ab, um die Flüssigkeit zu verteilen. Inkubieren Sie das Deckglas 2 Stunden lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Deckgläser nach der Inkubation dreimal 1 Minute lang pro Waschgang in PBS. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper in Verdünnungspuffer und Vortex, bis er gut vermischt ist. Wie zuvor beschrieben werden 10 Mikroliter Sekundärantikörper auf jedes Deckglas auftragen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.

Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS – und einmal mit Wasser – für 1 Minute pro Waschgang. Montieren Sie sie dann mit einem Eindeckmedium auf Glycerinbasis, das DAPI enthält, auf Objektträger. Versiegeln Sie Deckgläser mit transparentem Nagellack und lassen Sie sie 20 Minuten trocknen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die 60X-Objektivlinse und lokalisieren Sie die Kerne mit DAPI durch das Okular.

Öffnen Sie für die XYZ-Bildaufnahme die Erfassungssoftware und stellen Sie den "Scannertyp" auf "Galvano", den "Scanner-Modus" auf "Roundtrip" und die Bildgröße "512 x 512" ein. Stellen Sie im PMT-Bedienfeld den Modus auf VBM, den Durchschnitt auf Frame und den sequenziellen Scan auf Linie ein. Stellen Sie als Nächstes die Farb- und Wärmedetektoren ein. Stellen Sie Kanal 1 auf DAPI und SD1, Kanal zwei auf Alexa Fluor 488 und HSD3 und Kanal 3 auf Alexa Fluor 647 und HSD4 ein. Wählen Sie "EIN" in "Z".

Um das Live-Bild anzupassen, drücken Sie die Live-Taste im Live-Fenster und stellen Sie den Fokus ein. Verwenden Sie dann das Fenster "PMT-Tool", um die Intensität, Empfindlichkeit, Verstärkung und den Offset des Lasers einzustellen. Wählen Sie für Z-Stapel die Option Start bis Ende und 15 Segmente aus. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen, und drücken Sie die LSM-Start-Taste, um mit der Aufnahme zu beginnen. Wenn Sie fertig sind, drücken Sie die Schaltfläche Serie fertig, um die Bildaufnahme abzuschließen.