RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Um RNA-bindende Proteine oder RBPs – posttranskriptionelle Regulatoren – zu isolieren, nehmen Sie eine Suspension von kleinen RNA-Sonden ein, die ein Adenylat-Uridylat-reiches Element (ARE) enthalten – eine Sequenz, die von den Ziel-RBPs erkannt wird. Die RNA-Sonden sind mit Desthiobiotin markiert – einem Biotin-Derivat.

Fügen Sie magnetische Kügelchen hinzu, die mit Streptavidin beschichtet sind – einem Protein mit einer Affinität zu Biotin. Unter Rühren inkubieren, um zu verhindern, dass sich die Kügelchen absetzen. Desthiobiotin-markierte RNA bindet an Streptavidin und immobilisiert so die RNA auf den Kügelchen.

Unter dem Magnetfeld sammeln sich die Kügelchen an der Seite der Röhre. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Puffer, der einen optimalen pH-Wert für die RBP-RNA-Bindung bietet.

Wenn sie dem Magneten ausgesetzt werden, sammeln sich Perlen an der Seite des Rohrs. Entsorgen Sie den Überstand. Die Kügelchen werden in einer Lösung, die die Ziel-RBPs enthält, resuspendiert und unter Rühren inkubiert.

Die Ziel-RBPs besitzen RNA-Erkennungsmotive, die die ARE-Sequenz erkennen und an die RNA binden, wodurch ein RNA-Protein-Komplex gebildet wird, der auf den Kügelchen immobilisiert ist.

Unter dem Magnetfeld bewegen sich die Kügelchen auf den Magneten zu, ohne die Protein-RNA-Wechselwirkungen zu stören. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem biotinhaltigen Elutionspuffer.

Biotin verdrängt das Desthiobiotin aus den Kügelchen, indem es kompetitiv an Streptavidin bindet und so den Protein-RNA-Komplex eluiert.

Beurteilen Sie das Vorhandensein der Ziel-RBPs im Eluat, um die Protein-RNA-Wechselwirkungen zu bestätigen.

50 Mikroliter Streptavidin-magnetische Kügelchen pro 50 Picomole RNA vorwaschen. Wirbeln Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang mit Streptavidin-Magnetkügelchen ein. Nach dem schnellen Vortexen 200 Mikroliter mit abgeschnittenen Pipettenspitzen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Röhrchen geben. Stellen Sie dann die Röhre auf einen magnetischen Ständer, so dass sich die Kügelchen an der Seite der Röhre sammeln, und warten Sie eine Minute. Entfernen Sie die Resuspensionsflüssigkeit.

Um die Kügelchen zu waschen, nehmen Sie das Röhrchen bei 400 Mikrolitern 0,1 molar Natriumhydroxid und 0,05 molar Natriumchloridlösung vom Magnetständer und pipettieren Sie es mehrmals vorsichtig auf und ab. Setzen Sie das Röhrchen wieder auf den Magnetständer und warten Sie eine Minute, dann sammeln Sie den Überstand.

Waschen Sie die Kügelchen mit 200 Mikrolitern 100-Millimolar-Natriumchlorid und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 200 Mikroliter 20 millimolare Tris hinzu. Suspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren wieder und stellen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer. Entfernen Sie nach einer Minute den Überstand. Entfernen Sie dann das Röhrchen bei 200 Mikrolitern 1x RNA-Capture-Puffer vom Magnetständer und resuspendieren Sie die Streptavidin-Magnetkügelchen durch kurzes Vortexen.

Entfernen Sie 50 Mikroliter Streptavidin-Magnetkügelchen und geben Sie sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze in jedes markierte RNA-Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Walze. Nachdem sich das Röhrchen eine Minute lang auf dem Magnetstativ befunden hat, entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 50 Mikroliter 20 millimolare Tris zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie. Legen Sie dann die Röhren in den Magnetständer. Entfernen Sie nach einer Minute den Überstand.

Geben Sie 100 Mikroliter 1x Protein-RNA-Bindungspuffer zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie. Setzen Sie dann die Röhren wieder in den Magnetständer ein. Sobald die Röhrchen 1 Minute im Ständer waren, sammeln Sie den Überstand. Fügen Sie 100 Mikroliter Mastermix B hinzu. Resuspendieren Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren und Blasenbildung vermeiden. Reaktionsgefäße werden 60 Minuten lang bei 4 Grad Celsius auf einer Walze inkubiert.

Fahren Sie mit den Wasch- und Elutionsschritten fort. Legen Sie die Röhren in einen Magnetständer. Sammeln Sie den Durchfluss und übertragen Sie ihn in ein neues Rohr. Pipettieren Sie 100 Mikroliter 1X Waschpuffer auf die Kügelchen. Sanft resuspendieren. Stellen Sie sie wieder in den Ständer. Warten Sie eine Minute und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Schritt zweimal.

Geben Sie 40 Mikroliter Elutionspuffer zu den magnetischen Kügelchen. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren und auf einem Röhrchenschüttler inkubieren. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, warten Sie eine Minute und entnehmen Sie eine Eluatprobe. Auf Eis legen und für die nachgelagerte Analyse verwenden.