RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Um RNA-bindende Proteine oder RBPs – posttranskriptionelle Regulatoren – zu isolieren, nehmen Sie eine Suspension von kleinen RNA-Sonden ein, die ein Adenylat-Uridylat-reiches Element (ARE) enthalten – eine Sequenz, die von den Ziel-RBPs erkannt wird. Die RNA-Sonden sind mit Desthiobiotin markiert – einem Biotin-Derivat.

Fügen Sie magnetische Kügelchen hinzu, die mit Streptavidin beschichtet sind – einem Protein mit einer Affinität zu Biotin. Unter Rühren inkubieren, um zu verhindern, dass sich die Kügelchen absetzen. Desthiobiotin-markierte RNA bindet an Streptavidin und immobilisiert so die RNA auf den Kügelchen.

Unter dem Magnetfeld sammeln sich die Kügelchen an der Seite der Röhre. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Puffer, der einen optimalen pH-Wert für die RBP-RNA-Bindung bietet.

Wenn sie dem Magneten ausgesetzt werden, sammeln sich Perlen an der Seite des Rohrs. Entsorgen Sie den Überstand. Die Kügelchen werden in einer Lösung, die die Ziel-RBPs enthält, resuspendiert und unter Rühren inkubiert.

Die Ziel-RBPs besitzen RNA-Erkennungsmotive, die die ARE-Sequenz erkennen und an die RNA binden, wodurch ein RNA-Protein-Komplex gebildet wird, d