Quantitative Durchflusszytometrie zur Untersuchung markierter Protein-Phospholipid-Vesikel-Wechselwirkungen

0 Ansichten2:43 Min. • July 8th, 2025

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Protein-Phospholipid-Wechselwirkungen auf der Zellmembran sind entscheidend für die Regulation verschiedener zellulärer Prozesse.

Um Zielprotein-Phospholipid-Wechselwirkungen in vitro mit quantitativer Durchflusszytometrie nachzuweisen, nehmen Sie ein Röhrchen mit einer gewünschten Konzentration an Zellmembran-Nachahmung – mikrometergroße, lipophile, farbstoffmarkierte Phospholipid-Vesikel – in Puffer.

Geben Sie eine geeignete Konzentration verschiedener fluoreszenzmarkierter Zielproteine in Lösung.

Injizieren Sie die Suspension in das Durchflusszytometer. Stellen Sie die Parameter des Fluidiksystems auf eine niedrige Durchflussrate ein, um genügend Zeit für die Protein-Phospholipid-Wechselwirkungen zu haben.

Da die fluoreszenzmarkierten Proteine und die Phospholipid-Vesikel im Strömungskanal interagieren, steigt die Konzentration der an die Vesikel gebundenen Proteine.

Wenn diese Komplexe die Laserstrahlen von bestimmten Fluoreszenzkanälen passieren, die geeignete Wellenlängen bereitstellen, werden sie angeregt. Diese angeregten Proteine und Phospholipid-Vesikel in dem Komplex senden bei Entspannung in den Grundzustand entsprechende Fluoreszenzsignale aus, die von den entsprechenden Detektoren erfasst werden.

Der Nachweis einer hohen mittleren Fluoreszenzintensität der Proteine ist ein Hinweis auf eine Proteinbindung an die Phospholipidvesikel.

Beginnen Sie die kinetischen Bindungsexperimente, indem Sie Phospholipid-Vesikel im Tyrode-Puffer auf eine Konzentration von 1 Mikromolar und ein Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern verdünnen. Mischen Sie dann fluoreszenzmarkierten Gerinnungsfaktor X oder fX-fd in einer Konzentration von 500 Nanomolar mit den Phospholipid-Vesikeln im Verhältnis 1:1, um ein Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten.

Injizieren Sie sofort 500 Mikroliter der gemischten Suspension in das Durchflusszytometer mit einer Durchflussrate mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einem Emissionsfilter von 585 Nanometern mit einer Breite von 42 für den Kanal FL2.

Als nächstes messen Sie die mittlere Fluoreszenz im Kanal FL4 mit Anregung bei 633 Nanometern und Emissionsfilter bei 660 Nanometern mit einer Breite von 20. Wenn die Sättigung der Bindung erreicht ist, verdünnen Sie die Probe schnell um das 20-fache mit Tyrode-Puffer und überwachen Sie die Dissoziation, bis eine Ausgangsfluoreszenz oder ein Plateau erreicht ist.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026