Größenausschlusschromatographie mit Mehrwinkel-Lichtstreuung für Proteinoligomere

Ein Proteinoligomer ist ein Komplex aus mehreren Proteinuntereinheiten, die miteinander verbunden sind, um eine größere funktionelle Einheit zu bilden.

Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinmonomeren und deren Oligomeren in Lösung mittels SEC-MALS, einer Kombination aus Größenausschlusschromatographie und Mehrwinkel-Lichtstreuung, beginnen Sie mit einer Größenausschlusschromatographie (SEC) Säule.

Die Säule enthält poröse, siebartige kugelförmige Gelkügelchen, die kleinere Moleküle in sich einschließen. Äquilibrieren Sie die Säule mit einem Puffer, der mit dem nativen Zustand des Proteins kompatibel ist.

Laden Sie eine Probe mit Proteinmonomeren und -oligomeren an den oberen Rand der Säule.

Während der Strömung passieren die Oligomere den Zwischenpartikelraum der Säule, während die Monomere in den Poren der Kügelchen eingeschlossen werden. Dies führt dazu, dass die größeren Proteinoligomere schneller reisen als die kleineren.

Richten Sie die schnell eluierenden Oligomere, gefolgt von den langsam eluierenden Monomeren, auf den MALS-Detektor.

Beim Passieren des Detektors werden sie von einem Laserlicht beleuchtet, das in verschiedenen Winkeln gestreut wird. Die Oligomere mit mehreren Untereinheiten streuen mehr Licht als das Monomer.

Die Intensität des Streulichts in mehreren Winkeln ist direkt proportional zum Molekulargewicht des Proteins, des Oligomers und des Monomers.

Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Vorbereitung des SEC-MALS-Systems, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie unter Verwendung von Reagenzien in HPLC-Qualität einen Liter phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 50 bis 100 Millilitern Natriumchlorid vor. Filtern Sie den Puffer mit einem Polyethersulfonfilter oder ähnlichem auf 0,1 Mikron.

Die ersten 50 bis 100 Milliliter Puffer in eine Abfallflasche filtrieren, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen. Filtern Sie dann den Rest in eine saubere, sterile Flasche, die zuvor mit gefiltertem, entionisiertem Wasser gewaschen und aufbewahrt wurde, um das Eindringen von Staub zu verhindern.

Spülen Sie die Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute, um die Säule im Puffer auszugleichen und Partikel zu entfernen. Verwenden Sie den FPLC-Modus "Kontinuierlicher Fluss" und stellen Sie sicher, dass der Fluss nicht stoppt, bis alle SEC-MALS-Läufe abgeschlossen sind. Versetzen Sie die dRI-Durchflusszelle während der Nachtspülung in den Spülmodus.

Zu Beginn der Spülung die Durchflussmenge schrittweise erhöhen, um den "Säulenabwurf"-Effekt zu vermeiden, der durch eine plötzliche Druckänderung in der Säule verursacht wird. Deaktivieren Sie die Bereinigung, bevor Sie mit Beispielläufen beginnen.

Überprüfen Sie die Sauberkeit des Systems, indem Sie leicht auf den Schlauch hinter der Säule klopfen, um angesammelte Partikel freizusetzen. Beobachten Sie das Signal im 90-Grad-Detektor auf dem Display auf der Vorderseite des MALS-Instruments. Stellen Sie sicher, dass das Spitze-Spitze-Rauschen nicht mehr als 50 bis 100 Mikrovolt beträgt. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Brechungsindex oder das RI-Signal bei weniger als 1 x ^10-7 Brechungsindexeinheiten stabil ist.

Führen Sie eine "leere" Injektion durch, um zu überprüfen, ob der Injektor frei von Partikeln ist. Ein "Blanko" ist einfach der laufende Puffer, der in einem frischen sterilen Fläschchen hergestellt wird. Wenn der Partikelpeak nicht mehr als 1 Milliliter Volumen und nicht mehr als 5 Millivolt über dem Ausgangswert beträgt, ist das System bereit für Proben. Andernfalls führen Sie zusätzliche Blindinjektionen durch, bis sie sauber sind, oder führen Sie Wartungsarbeiten durch, um den Injektor zu reinigen.

Bereiten Sie nun mindestens 200 Mikroliter BSA mit 1 bis 2 Milligramm pro Milliliter im SEC-Puffer vor. Filtern Sie das Protein mit einem Spritzenspitzenfilter auf 0,025 Mikrometer. Entsorgen Sie die ersten Tropfen Filtrat, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen. Alternativ können Sie die Probe 15 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugieren, um die Ausfällung von unlöslichen Aggregaten und anderen großen Partikeln zu ermöglichen. Injizieren Sie dann 100 Mikroliter der BSA-Lösung in die Schlaufe.