ELISA-basierter Reporter-Assay zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Interaktion in BW-Zellen

Um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu untersuchen, beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die Medien mit Zielzellen enthält, die Testliganden auf ihrer Oberfläche exprimieren.

Fügen Sie manipulierte Maus-BW-Zellen hinzu – eine neuartige B-Zell-Population, die membrangebundene chimäre Rezeptoren exprimiert. Chimäre Rezeptoren bestehen aus der extrazellulären Domäne eines bestimmten Rezeptors, die mit der Transmembran und der intrazellulären Signaldomäne des B-Zell-Rezeptors fusioniert ist.

Liganden auf den Zielzellen interagieren mit der extrazellulären Domäne der chimären Rezeptoren der BW-Zellen und bewirken so eine Aktivierung der intrazellulären Signaldomäne in den BW-Zellen. Dies löst die nachgelagerte Signalübertragung und die Produktion von Zytokinen aus – sekretorische Reportermoleküle, die außerhalb der BW-Zellen freigesetzt werden und in den Medien erscheinen.

Zentrifugieren Sie die Platte. Der zytokinhaltige Überstand wird in eine ELISA-Platte überführt, die mit Anti-Zytokin-Antikörpern vorbeschichtet ist. Zytokine interagieren mit den Fab-Regionen der Antikörper, was zu ihrer Immobilisierung auf der Plattenoberfläche führt.

Behandeln Sie die Platte mit einer Blocklösung, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Fügen Sie biotinylierte Anti-Zytokin-Antikörper hinzu, die mit vorgebundenen Zytokinen interagieren und Immunkomplexe bilden.

Überlagern Sie die Platte mit einer enzymkonjugierten Streptavidin-Lösung. Streptavidin bindet mit Biotin an die Immunkomplexe.

Behandeln Sie die Platte mit einem Substrat. Die Enzym-Substrat-Wechselwirkung erzeugt ein farbiges Produkt, das der Lösung die gleiche Farbe verleiht. Die farbige Lösung bestätigt das Vorhandensein von Reportermolekülen, was auf eine erfolgreiche Rezeptor-Liganden-Interaktion hinweist.

Verwenden Sie 50.000 transfizierte BW-Zellen mit ihren gewünschten Zielen in einer einzigen Vertiefung einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang. Frieren Sie die Platte dann bei -20 Grad Celsius ein.

Beschichten Sie eine ELISA-Platte mit Anti-Maus-IL-2-Antikörper. Geben Sie 0,05 % Mikrogramm Anti-Maus-IL-2 in ein Volumen von 50 Mikrolitern PBS in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die beschichtete Platte über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Nutzen Sie eine kurze Inkubationszeit bei 37 Grad Celsius, um die gefrorenen BW-Zellen aufzutauen, die zuvor mit ihren Targets inkubiert wurden. Zentrifugieren Sie dann die Platte, übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung auf die vorbeschichtete ELISA-Platte und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie danach Biotin Anti-Maus-IL-2 auf die ELISA-Platte. Dann, nach der Inkubation und dem Waschen, HRP-konjugiertes Streptavidin auf die Platte geben. Geben Sie nach der Inkubation und dem Waschen 100 Mikroliter der TMB-Substratlösung in jede Vertiefung der ELISA-Platte. Zum Schluss lesen Sie die ELISA-Platte bei 650 Nanometern ab.