Gitterlichtblattmikroskopie zur Visualisierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen in lebenden Zellen

Die Gitterlicht-Blatt-Mikroskopie, LLSM, ermöglicht die Visualisierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zwischen Zelloberfläche und Zelloberfläche in lebenden Zellen mit hoher raumzeitlicher Auflösung.

Nehmen Sie ein Deckglas mit transduzierten Liganden-exprimierenden Zellen, die rote Fluoreszenz emittieren. Befestigen Sie das Deckglas mit der Küvette nach oben auf einem gefetteten Probenhalter. Befestigen Sie die Halterung am Piezo eines Mikroskoptisches, um eine präzise Positionierung und Abtastung der Probe während der Bildgebung zu ermöglichen. Passen Sie die Softwareeinstellungen so an, dass der Fokus auf eine einzelne ligandenexprimierende Zelle gelegt wird.

Pipettieren Sie die Rezeptor-exprimierende Zellsuspension auf das Deckglas. Die Rezeptoren sind mit grün fluorophormarkierten Antikörpern markiert. Stellen Sie sich die interagierenden Zellpaare vor.

Der Anregungslaser des Mikroskops sendet einen zirkularen, linear polarisierten Laserstrahl aus, der durch zylindrische Linsen geht, um ein Lichtblatt zu erzeugen. Das Lichtblatt wird auf einen Modulator projiziert, der überschüssige Beugung entfernt und in ein ultradünnes Gittermuster umwandelt.

Das Gitterlichtblatt beleuchtet einen ultradünnen Abschnitt des wechselwirkenden Zellpaares, und die von den wechselwirkenden Zellen emittierte Fluoreszenz wird senkrecht zum einfallenden Strahl erfasst. Stellen Sie das interagierende Zellpaar in mehreren Z-Ebenen dar und nehmen Sie mit einer Hochgeschwindigkeitskamera zweidimensionale Bilder in jeder Fokusebene auf.

Kombinieren Sie diese Bilder mit geeigneter Software zu einem Z-Stapel – einem hochauflösenden vierdimensionalen Bild, das die raumzeitliche Dynamik der Rezeptor-Liganden-Interaktion zwischen Zelloberfläche und Ligand zeigt.

Geben Sie 10 Milliliter Wasser und 30 Mikroliter Fluorescein in das LLSM-Bad. Drücken Sie zunächst Bild (Start), um das Objekt in die Bildposition zu verschieben, und betrachten Sie ein Laserstrahlmuster mit einem einzelnen Gefäß.

Richten Sie den Laserstrahl mithilfe der Führungslinie und des voreingestellten Interessenbereichs aus, um den Strahl zu einem dünnen Muster zu machen, das in alle Richtungen ausbalanciert ist. Der Strahl sollte auch in der Sucherkamera fokussiert erscheinen. Verwenden Sie die beiden Versteller der Spiegelneigung, das obere Fokusmikrometer und die Objektivfarbe, um den Strahl einzustellen.

Waschen Sie anschließend das Bad und die Objektive mit mindestens 200 Millilitern Wasser, um das Fluorescein vollständig zu entfernen.

Um fluoreszierende Standardperlen abzubilden, aktivieren Sie Dither, indem Sie im Feld "X Galvo Range" die Option auf 3 setzen, und drücken Sie Live, um das aktuelle Feld anzuzeigen. Stellen Sie den Neigungsspiegel, die Objektivfarbe und das Fokusmikrometer manuell ein, um die höchsten Grauwerte zu erzielen. Passen Sie dann nach Bedarf an, um die richtigen Muster für die Erfassungsmodi Objektiv-Scan, Z-Galvo, Z plus Objektiv und Proben-Scan zu erhalten. Drücken Sie danach die Taste "Im Sample-Scan-Modus ausführen", um die Funktion "Sample-Point-Spread" für die Entzerrung und Dekonvolution zu erfassen. Ändern Sie die Laser in den Dreifarbenmodus und drücken Sie erneut Ausführen.

Geben Sie zunächst 100.000 antigenpräsentierende Zellen auf das vorbereitete kreisförmige Deckglas mit einem Durchmesser von 5 Millimetern und lassen Sie sie 10 Minuten lang ruhen. Fetten Sie den Probenhalter ein und legen Sie das Deckglas mit der Zellseite nach oben darauf.

Geben Sie anschließend einen Tropfen Bildmedium auf die Rückseite des Deckglases. Schrauben Sie den Probenhalter auf den Piezo und drücken Sie Bild (Start). Suchen Sie eine Antigen-präsentierende Zelle, um sie abzubilden, und stellen Sie sicher, dass das LLSM und die Bildgebungssoftware ordnungsgemäß funktionieren.

Drücken Sie Live, um das aktuelle Bild anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang Z, um das Deckglas und die Zellen zu finden. Suchen Sie das Zentrum einer Antigen-präsentierenden Zelle, indem Sie sich in Z-Richtung bewegen, und drücken Sie dann Stopp, um den Laser anzuhalten. Aktivieren Sie 3D und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein. Drücken Sie die Eingabetaste und dann die Ausführungstaste, um die Daten zu erfassen.

Senken Sie den Tisch in die Lastposition ab und geben Sie 50 Mikroliter T-Zellen tropfenweise direkt über das Deckglas in das Bildgebungsmedium. Lassen Sie am besten einen Tropfen am Ende der Pipettenspitze entstehen und berühren Sie dann die Spitze mit der Badeflüssigkeit. Heben Sie die Bühne wieder an, indem Sie auf Bild (Zurück) klicken.

Beginnen Sie mit der Bildgebung. Stellen Sie sicher, dass Sie den gewünschten Z-Stack und die Zeitrafferlänge einstellen. Stellen Sie sich z. B. 60 Z-Stacks in Schritten von 0,4 Mikrometern vor und geben Sie 500stel-Zeitrahmen ein. Stoppen Sie die Aufnahme, bevor 500 Bilder erreicht sind, um Photobleaching zu vermeiden. Verwenden Sie den Live-Modus, um nach Zellpaaren zu suchen, und wenn Sie die gewünschten Einstellungen eingegeben haben, drücken Sie Ausführen, um Daten zu erfassen.