Warum ist die Messung der Kinetik der DNA-Entwicklung für die Zielvalidierung wichtig?

Die Messung der Kinetik der DNA-Aufwicklung liefert einen direkten funktionellen Nachweis der Nukleosomenstabilität und ermöglicht eine quantitative Beurteilung der Bindung an epigenetische Zielstrukturen. Diese Messung unterstützt die Zielstrukturvalidierung, indem sie biophysikalische Veränderungen mit transkriptionellen Ergebnissen in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft. Die kinetischen Daten ermöglichen eine mechanistische Ent风险bewertung, indem sie verdeutlichen, wie Verbindungen im Zeitverlauf die Chromatinzugänglichkeit beeinflussen.

Wie passt die Isolierung des Nukleosoms als unabhängige Variable in die Entdeckungspipeline?

Die Isolierung von Nukleosomen auf einem funktionalisierten Glimmer-Substrat ermöglicht eine kontrollierte Beobachtung des DNA-Aufwickelns ohne störende zelluläre Faktoren. Dieser reduktionistische Ansatz eignet sich für frühe Entdeckungen, da er ein definiertes System bereitstellt, um die Wirkung von Verbindungen auf zentrale Chromatin-Mechanismen zu testen. Das isolierte System unterstützt die Assay-Entwicklung, indem es reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für Screening-Kampagnen liefert.

Welche quantitativen abhängigen Variablenmessungen ermöglichen die Identifizierung von Leads?

Zeitaufgelöste Messungen der Nukleosomenhöhe dienen als abhängige Variable zur Quantifizierung von DNA-Aufwickelungsereignissen und -kinetiken. Diese Messungen ermöglichen die Identifizierung von Wirkstoffen, indem sie einen direkten Vergleich der Wirkstoffeffekte auf die Stabilität und Dynamik von Nukleosomen erlauben. Die quantitativen Ergebnisse unterstützen die Analyse von Struktur-Wirkungs-Beziehungen, indem sie chemische Modifikationen mit Veränderungen im Chromatinverhalten korrelieren.

Warum sind Anforderungen an die Reproduzierbarkeit für die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Fachbereichen wichtig?

Replikationsanforderungen gewährleisten konsistente Bedingungen für die Nukleosomen-Immobilisierung und -Abbildung innerhalb der Experimente, was für einen zuverlässigen Datenaustausch zwischen Teams unerlässlich ist. Standardisierte Protokolle zur Funktionalisierung von Glimmer und zum Pufferaustausch ermöglichen reproduzierbare Ergebnisse, die kollaborative Bemühungen zur Target-Validierung unterstützen. Eine einheitliche Replikation verringert die Variabilität von kinetischen Messungen und erhöht somit das Vertrauen in die datenbasierte Interpretation über verschiedene Projekte hinweg.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind vor der Implementierung erforderlich?

Die Implementierung erfordert Fähigkeiten zur kinetischen Analyse von Zeitrafferdaten, einschließlich der Ereigniserkennung und der Bestimmung von Geschwindigkeitskonstanten aus den Trajektorien der Nukleosomhöhe. Statistische Werkzeuge sind erforderlich, um die Häufigkeiten des Abwickelns, Verweilzeiten sowie Übergangsraten zwischen verpackten und entpackten Zuständen zu quantifizieren. Diese Analysemöglichkeiten ermöglichen es Teams, Bedingungen zu vergleichen und die Wirkung von Substanzen mit der für fundierte Entscheidungen erforderlichen Genauigkeit zu bewerten.

Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie zur Erfassung der Nukleosomendynamik

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Techniken

0 Ansichten • 4:56 Min. • July 8th, 2025

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Nukleosomen – eukaryotische DNA-Repeating-Einheiten – bestehen aus DNA-Segmenten, die um Histon-Proteinkerne gewickelt sind. Die DNA-Enthüllung um den Histonkern ist entscheidend für die Dynamik der Nukleosomen.

Um die Dynamik des Nukleosoms zu erfassen, beginnen Sie mit einem glatten, funktionalisierten Glimmersubstrat, das auf einem Rasterkraftmikroskop, einem AFM, einem Scannertisch montiert ist. Überlagern Sie das Substrat mit einem nukleosomenhaltigen Puffer.

Die negativ geladene Nukleosomen-DNA interagiert mit positiven Ladungen auf dem funktionalisierten Glimmer und immobilisiert sie auf der Oberfläche. Waschen Sie das immobilisierte Glimmersubstrat mit einem Puffer, um eine Überfüllung der Nukleosomen zu verhindern.

Übertragen Sie den nukleosomenhaltigen Scannertisch in eine Bildgebungskammer mit einem vormontierten Cantilever, mit einer Spitze am Rand und nach oben zu den Nukleosomen.

Füllen Sie die Kammer mit einem Imaging-Puffer. Richten Sie den Laserstrahl auf die Auslegerrückseite aus, um genaue Ablenkungsmessungen zu gewährleisten.

Die AFM-Spitze oszilliert nahe an den vollständig umhüllten Nukleosomen und scannt die Oberfläche, um in regelmäßigen Abständen die Höhe der Nukleosomen zu messen.

Die spontane DNA-Enthüllung erhöht die Höhe des Nukleosoms, wodurch sich die Oszillationen der Spitze abwechseln und eine Auslenkung des Cantilevers entsteht. Diese Cantilever-Ablenkung verschiebt die Position des reflektierten Laserstrahls, was von einem positionsempfindlichen Detektor erfasst wird und topographische Nukleosomenbilder erzeugt.

Auf AFM-Bildern erscheint der Histonkern als leuchtender Klumpen mit unverpackter DNA, die im Laufe der Zeit immer höher wird, was auf die Dynamik des Nukleosoms hinweist.

Verwenden Sie Glasstab-Scanner-Kleber, um einen Glasstab am AFM-Scannertisch zu befestigen. Lassen Sie dies mindestens 10 Minuten trocknen. In der Zwischenzeit werden 0,1 Millimeter dicke kreisförmige Glimmerstücke mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern hergestellt, indem du sie aus einer größeren Glimmerplatte stanzt. Verwenden Sie den Hochgeschwindigkeits-AFM-Glimmer-Glasstabkleber, um dieses Glimmerstück an den Glasstab des Hochgeschwindigkeits-AFM zu befestigen, und lassen Sie es mindestens 10 Minuten lang unberührt, während es trocknet.

Trennen Sie dann die Schichten mit einem druckempfindlichen Klebeband vom Glimmer, bis eine gut gespaltene Schicht auf dem Klebeband zu sehen ist. Als nächstes verdünnen Sie 1 Mikroliter 50-Millimolar-APS-Stamm in 99 Mikrolitern destilliertem deionisiertem Wasser, um eine 500-Mikromolare APS-Lösung herzustellen. 2,5 Mikroliter der Lösung auf die frisch gespaltene Glimmeroberfläche geben und die Oberfläche 30 Minuten lang funktionalisieren lassen.

Spülen Sie den Glimmer nach der Inkubation mehrmals mit destilliertem deionisiertem Wasser ab, indem Sie 3-Mikroliter-Spülungen anwenden. Entfernen Sie das Wasser nach jedem Spülen vollständig, indem Sie ein Vliestuch an den Rand des Glimmers legen. Geben Sie nach dem letzten Spülen 3 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser auf die Oberfläche und lassen Sie es mindestens 5 Minuten einwirken, um unspezifisch gebundenes APS zu entfernen.

Setzen Sie dann die Sonde in den Hochgeschwindigkeits-AFM-Halter ein und positionieren Sie den Halter mit der Spitze nach oben auf dem AFM-Tisch. Spülen Sie den Halter mit 100 Mikrolitern destilliertem deionisiertem Wasser, gefolgt von zwei 100-Mikroliter-Spülungen mit 0,22-Mikron-gefiltertem Nukleosomen-Imaging-Puffer. Füllen Sie nach den Spülungen die Kammer mit 100 Mikrolitern Nukleosomen-Imaging-Puffer und tauchen Sie die Spitze ein.

Passen Sie die Auslegerposition an, bis er vom Laser getroffen wird. Spülen Sie dann den APS-Glimmer fünfmal mit gefiltertem Nukleosomen-Imaging-Puffer mit 4 Mikrolitern pro Spülgang. Verdünnen Sie 1 Mikroliter des Nukleosomen-Assemblierungsmaterials in 250 Mikroliter gefilterten Nukleosomen-Imaging-Puffer, um eine endgültige Nukleosomenkonzentration von 1 Nanomolar zu erhalten.

Geben Sie 2,5 Mikroliter dieser Verdünnung auf die Oberfläche und lassen Sie sie 2 Minuten einwirken. Spülen Sie die Oberfläche zweimal mit 4 Mikrolitern Nukleosomen-Imaging-Puffer ab, um eine Überfüllung zu vermeiden. Lassen Sie die Oberfläche nach dem letzten Spülen mit Bildgebungspuffer bedeckt. Setzen Sie den Scanner und die Probe so auf den Spitzenhalter, dass die Probe mit der Vorderseite nach unten zeigt.

Um den Anflug zu starten, verwenden Sie die Auto-Annäherungsfunktion mit einer Sollwertamplitude nahe der freien Schwingungsamplitude. Passen Sie den Sollwert an, bis die Oberfläche gut nachgeführt wird. Stellen Sie dann den Bildbereich auf etwa 150 x 150 Nanometer bis 200 x 200 Nanometer ein, mit einer Datenerfassungsrate von etwa 300 Millisekunden pro Bildaufnahme.