Transmissionselektronenmikroskopie zur Quantifizierung der Glykogenverteilung in der menschlichen Skelettmuskulatur

Glykogen, ein verzweigtes Glukosepolymer, ist eine Energiereserve in subzellulären intermyofibrillären, intramyofibrillären und subsarkolemmalen Kompartimenten innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur.

Um die subzelluläre Glykogenverteilung mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zu quantifizieren, wird isoliertes menschliches Skelettmuskelgewebe gewonnen. Mit Glutaraldehyd fixieren, um die Gewebestruktur zu erhalten. Das Gewebe wird nach dem Fixieren in einer Osmiumtetroxid- und Kaliumferrocyanidlösung fixiert.

Der reduzierte Osmium-Ferrocyanid-Komplex bindet an die Hydroxylgruppen im Glykogen und verbessert so den Kontrast der Glykogenpartikel im Muskel. Zusätzlich werden Membranen und sarkoplasmatisches Retikulum – ein membrangebundenes Organell – gefärbt.

Dehydrieren Sie das Gewebe bei steigenden Ethanolkonzentrationen. In Harz einbetten und einen festen Block bilden. Erhalten Sie ultradünne Schnitte mit längsorientierten Muskelfasern; Übertragung auf TEM-Gitter.

Tauchen Sie die Gitter in Uranylacetat, Schwermetalllösung. Uranyl-Ionen binden an negativ geladene Lipide und Proteine und machen sie elektronendicht. Mit Bleicitratlösung färben.

Blei-Ionen binden an die Osmium-gefärbten Regionen, einschließlich der Glykogenpartikel, und verstärken so den Kontrast. Sie binden auch an Uranylacetat-umgesetzte Regionen, wodurch die Elektronentrübung verstärkt wird.

Während der TEM-Bildgebung, wenn Elektronenstrahlen das Gewebe durchdringen, streuen gefärbte elektronendichte Bereiche, einschließlich Glykogen, mehr Elektronen, während ungefärbte Bereiche Elektronen übertragen.

In dem kontrastreichen TEM-Bild erscheinen Glykogenpartikel deutlich und dunkel, ungefärbte Regionen erscheinen heller, was die Visualisierung und Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung im Muskel erleichtert.

Isolieren Sie eine kleine Probe aus der Muskelbiopsie oder dem ganzen Muskel, die einen maximalen Durchmesser von 1 Millimeter in eine beliebige Richtung hat und in Längsrichtung länger als im Querschnitt ist.

Legen Sie die Probe in das Röhrchen mit der kalten primären Fixierlösung. Lagern Sie es 24 Stunden lang bei 5 Grad Celsius. Waschen Sie die Probe dann 4 Mal in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Entfernen Sie mit Hilfe von Transferpipetten den gebrauchten Puffer aus dem Röhrchen, lassen Sie die Probe unberührt und fügen Sie den frischen Puffer hinzu. Die Probe wird 120 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit 1 % Osmiumtetroxid und 1,5 % Kaliumferrocyanid in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer fixiert.

Spülen Sie die Probe zweimal in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur ab. Dehydrieren durch Eintauchen in eine abgestufte Reihe von Ethanol bei Raumtemperatur. Die Probe wird mit Propylenoxid und epossidischen Harzgemischen bei Raumtemperatur unter Verwendung der genannten Volumenverhältnisse infiltriert.

Am nächsten Tag betten Sie die Proben in 100 % frisches epossidisches Harz in Formen ein und polymerisieren 48 Stunden lang bei 60 Grad Celsius.

Montieren Sie den Block einer Probe auf den Ultramikrotomhalter. Schneiden Sie den Block mit einer Rasierklinge auf die Oberfläche, um das Gewebeniveau zu erreichen. Montieren Sie ein Diamantmesser vor der Probe und richten Sie die Probenoberfläche parallel zum Messer aus.

Stellen Sie mit dem Diamantmesser einen halbdünnen Schnitt von 1 Mikrometer Dicke her, um die Ausrichtung der Probe zu überprüfen. Färben Sie den halbdünnen Schnitt mit Toluidinblau für die Betrachtung mit dem Lichtmikroskop. Schneiden Sie dann den Block weiter ab, um den interessierenden Bereich zu verkleinern und richtige ultradünne Schnitte zu erhalten.

Schneiden Sie ultradünne Schnitte mit einer Dicke von 60 bis 70 Nanometern mit einem zweiten Diamantmesser. Sammeln Sie 1 bis 2 Abschnitte auf Einloch-Kupfergittern mit einem Perfect Loop. Um die Abschnitte zu kontrastieren, tauchen Sie die Gitter 20 Minuten lang in Uranylacetatlösung und waschen Sie die Gitter in doppelt destilliertem Wasser, tauchen Sie dann die Gitter 15 Minuten lang in Bleicitrat und waschen Sie die Gitter erneut in doppelt destilliertem Wasser.

Schalten Sie das Transmissionselektronenmikroskop, den Computer und die Bildaufzeichnungssoftware ein. Nehmen Sie digitale Bilder mit einer digitalen CCD-Kamera mit langsamer Abtastung und der zugehörigen Bildgebungssoftware auf. Nachdem Sie das Gitter mit mehreren Schnitten in den Mikroskoptisch eingesetzt haben, screenen Sie das Gitter zunächst bei geringer Vergrößerung, um die Schnitte mit der besten Qualität auszuwählen und die Richtung der Muskelfasern zu bestimmen.

Fokussieren Sie als Nächstes das Bild bei einer Vergrößerung über 30.000, wobei der Strahl auf einer peripheren Faser im Schnitt zentriert ist, und nehmen Sie Bilder mit einer Belichtungszeit von 1 Sekunde bei der gewünschten Vergrößerung auf. Stellen Sie sicher, dass die Bilder über die Länge und Breite der Faser in einer zufälligen, aber systematischen Reihenfolge verteilt sind, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten, und wiederholen Sie die Bildgebung, bis 6 bis 10 Fasern abgebildet sind.

Importieren Sie Bilder in imageJ, indem Sie auf Datei und dann auf Öffnen klicken. Stellen Sie die globale Skalierung so ein, dass sie der Originalgröße des Bildes entspricht, indem Sie auf Analysieren und dann auf Skalierung festlegen klicken. Um 100% zu vergrößern, klicken Sie auf Bild, gehen Sie zu Zoom und klicken Sie auf In.

Messen Sie die Dicke einer Z-Scheibe pro Bild des myofibrillären Raums mit dem Werkzeug "Gerade Linie" aus dem Menü "Werkzeuge" und berechnen Sie die durchschnittliche Z-Scheibendicke jeder der 6 bis 10 Fasern. Verwenden Sie das Werkzeug "Segmentierte Linie", um die Länge des äußersten Myofibril zu messen, das direkt unter der subsarkolemmalen Region sichtbar ist.

Um ein Raster einzufügen, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Tools und dann Raster. Stellen Sie nun die Fläche pro Punkt auf 32.400 Quadratnanometer ein. Zählen Sie die Anzahl der Treffer innerhalb der verfügbaren Länge in den 12 subsarkolemmalen Bildern, bei denen ein Kreuz auf das subsarkolemmmale Glykogen trifft.

Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren klicken, wählen Sie dann Werkzeuge, gefolgt von Raster, und stellen Sie die Fläche pro Punkt auf 160.000 Quadratnanometer ein. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf den intramyofibrillären Raum trifft.

Um ein Raster einzufügen, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Tools und dann Raster. Legen Sie nun die Fläche pro Punkt auf 3.600 Quadratnanometer fest. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intramyofibrilläre Glykogen trifft.

Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren klicken, wählen Sie dann Werkzeuge, gefolgt von Raster, und stellen Sie die Fläche pro Punkt auf 32.400 Quadratnanometer ein. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intermyofibrilläre Glykogen trifft.

Wenn Sie das 32.400-Quadratmeter-Raster verwenden, um die Glykogenpartikel zufällig auszuwählen, beginnen Sie mit dem oberen linken Quadrat und bewegen Sie sich bei Bedarf nach links. Messen Sie mit dem Werkzeug "Geradlinige Linie" den Durchmesser von 5 zufällig ausgewählten Glykogenpartikeln jedes Pools für jedes der 12 Bilder, um einen Durchschnitt von 60 Partikeln pro Pool und Faser zu erhalten.