Isolierung von Monozyten aus Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:27 Min. • July 8th, 2025
Um Monozyten, eine Art weißer Blutkörperchen, aus Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion zu isolieren, erhalten Sie mit Antikoagulanzien behandeltes menschliches Blut in einem Röhrchen. Fügen Sie eine Antikörper-Cocktail-Lösung hinzu, die Fc-Rezeptor-blockierende Antikörper und bispezifische tetramere Antikörperkomplexe enthält.
Jeder Antikörperkomplex besteht aus zwei monoklonalen Antikörpern, wobei ein Antikörper spezifisch für Zelloberflächenantigene auf Nicht-Monozytenzellen, einschließlich weißer und roter Blutkörperchen, und der andere Antikörper spezifisch für Dextran ist.
Fügen Sie eine mit Dextran beschichtete magnetische Bead-Lösung hinzu. Ausbrüten. Der Fc-Rezeptor-blockierende Antikörper bindet an den Fc-Rezeptor der Monozyten und verhindert so eine unspezifische Bindung von monoklonalen Antikörpern.
Die monoklonalen Antikörper in Antikörperkomplexen erkennen und binden an spezifische Zelloberflächenantigene auf den Nicht-Monozytenzellen, während die Monozyten unmarkiert bleiben. Die mit Dextran beschichteten magnetischen Kügelchen binden an den Anti-Dextran-Antikörper der Antikörperkomplexe und vernetzen die Nicht-Monozytenzellen mit den Kügelchen.
Legen Sie das Rohr in eine Magnethalterung. Unter dem Einfluss eines hochgradienten Magnetfeldes binden die magnetisch perlenvernetzten Zellen an die Röhrenwände, wobei die Monozyten im Zentrum der Röhre zurückbleiben.
Die monozytenhaltige Lösung pipettieren und in ein frisches Röhrchen umfüllen. Fügen Sie magnetische Kügelchen hinzu und vernetzen Sie verbleibende unerwünschte Zellen. Unter den Einfluss eines Magnetfeldes stellen, wodurch die Monozytenpopulation angereichert wird.
Übertragen Sie die Monozytensuspension in ein frisches Röhrchen. Die Suspension zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Monozyten in einem Puffer für die weitere Analyse.
Nachdem Sie 40 Milliliter frisches menschliches Vollblut in vier 10-Milliliter-EDTA-Vakuumröhrchen gesammelt haben, verwenden Sie eine sterile Technik, um das gesamte Blut in ein einzelnes konisches 50-Milliliter-Propylenröhrchen in einer Biosicherheitswerkbank zu überführen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers aus einem ausgewählten humanen Monozyten-Isolationskit, geben Sie 2 Milliliter Monozyten-Isolationscocktail aus dem Kit in das Blutröhrchen und wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen 30 Sekunden lang aus dem Kit auf.
Geben Sie 2 Millimeter Kügelchen in das Blut und mischen Sie die Kügelchen vorsichtig mit dem Blut mit einer serologischen 25-Milliliter-Pipette. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wird das Blut gleichmäßig auf vier 50-Milliliter-Röhrchen aufgeteilt und 30 Milliliter steriles PBS, ergänzt mit 1 Millimolar EDTA, in jedes Röhrchen gegeben. Mischen Sie erneut mit einer serologischen 25-Milliliter-Plastikpipette und legen Sie die Röhrchen in Magnethalterungen.
Ziehen Sie nach 10 Minuten mit einer Pipette den Inhalt aus der Mitte jedes Röhrchens auf, achten Sie darauf, nicht mehr als 1 Milliliter rote Blutkörperchen abzusaugen, und geben Sie den Röhrcheninhalt in eines von vier neuen 50-Milliliter-Röhrchen ab. Geben Sie 500 zusätzliche Mikroliter der wirbelförmigen Magnetkügelchen in jedes Röhrchen und mischen Sie die Zelllösung vorsichtig. Legen Sie die Röhrchen für fünf Minuten wieder in die Magnethalterungen, bevor Sie den Inhalt vorsichtig aus der Mitte jedes Röhrchens in eines von vier neuen 50-Millimeter-Röhrchen umfüllen.
Wenn alle Zellsuspensionen übertragen wurden, legen Sie jedes neue 50-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang in die Magnethalter, bevor Sie den Röhrcheninhalt vorsichtig in einen dritten Satz von vier neuen 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Sammeln Sie dann die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie alle vier Zellpellets in insgesamt 10 Millilitern sterilem PBS zur Zählung.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung von Monozyten aus menschlichem Vollblut mittels immunmagnetischer negativer Selektion. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antikörpermischungen und magnetischen Kügelchen, um die Monozytenpopulation für weitere Analysen anzureichern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Immunologie
- Hämatologie
Hintergrund
- Monocyten sind eine Art weißer Blutkörperchen, die für die Immunantwort wichtig sind.
- Die Isolierung von Monocyten ist entscheidend, um ihre Funktion und ihr Verhalten zu untersuchen.
- Die immunmagnetische Negativauswahl ist eine Technik, die zur Anreicherung spezifischer Zellpopulationen verwendet wird.
- Diese Methode minimiert die Kontamination durch andere Zelltypen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Isolierung von Monozyten aus Vollblut bereitstellen.
- Die Reinheit der isolierten Monozyten für nachgeschaltete Anwendungen verbessern.
- Die Forschung zur Biologie von Monozyten und verwandten Erkrankungen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Sammlung von antikoagulansbehandeltem menschlichem Blut.
- Verwendung von Antikörpermischungen zur gezielten Bindung nicht-monozytärer Zellen.
- Anwendung von dextranbeschichteten magnetischen Mikrokügelchen zur Zellseparation.
- Zentrifugation und erneute Suspension der isolierten Monozyten in Puffer.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Monozyten mit minimaler Kontamination.
- Hohe Ausbeute an vitalen Monozyten für weitere Analysen.
- Reproduzierbarkeit des Protokolls in mehreren Versuchen nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Isolierung von Monozyten aus menschlichem Blut.
- Diese Technik kann in verschiedenen Forschungsbereichen angewendet werden.
- Zukünftige Studien können die isolierten Monozyten für immunologische Untersuchungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung primärer humaner Monozyten ermöglicht die mechanistische Untersuchung der Funktion von Immunzellen in Modellen entzündlicher und infektiöser Erkrankungen. Diese Methode unterstützt die Target-Validierung, indem sie ein gereinigtes zelluläres System bereitstellt, um die Wirkung von Substanzen auf monozytenvermittelte Signalwege zu bewerten. Hochreine Monozytenpräparationen erhöhen die Vorhersagesicherheit bei präklinischen Entwicklungsstrategien zur Risikominimierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Beurteilung monozytenspezifischer Zielstrukturen in einem physiologisch relevanten humanen Zellkontext.
- Operativer Wert: Verringert störende Signale durch kontaminierende Zelltypen bei Target-Bindungsstudien.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die hypothesengetriebene Untersuchung immunmodulierender Substanzen mit verbesserter translationaler Relevanz.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt ein konsistentes Monocyten-Substrat für die standardisierte Assay-Entwicklung in immunologisch ausgerichteten Screening-Kaskaden.
- Operativer Wert: Ermöglicht reproduzierbare Zellisolierung und liefert ein einheitliches Ausgangsmaterial für Dosis-Wirkungs- und kinetische Assays.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit der parallelen Verarbeitung mehrerer Spenderproben zur Beurteilung der Populationsvariabilität.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein für den Menschen relevantes System, um monocytenvermittelte Krankheitsmechanismen vor einer Validierung in vivo zu modellieren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Biomarker-Entdeckungsworkflows, indem Phospho-Flow-, Zytokinausschüttungs- und Phagozytose-Assays durchgeführt werden können.
- Risikominderung: Steigert das Target-Vertrauen, indem der Wirkmechanismus in einem krankheitsrelevanten humanen Zelltyp bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Assay-Entwicklung bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien ein und ermöglicht iterative Design-Make-Test-Zyklen.
- Entdeckungsbiologie Unterstützt die Isolierung von Monozyten zur Untersuchung von Signalwegen und zur Absicherung von Zielstrukturen in Immunologieprojekten.
- Screening: Ergibt gereinigte Monozyten, die für Hochdurchsatz-Screenings und funktionelle Nachweistests geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Messung der Monozytenaktivierung, der Zytokinproduktion und der Expression von Oberflächenmarkern.
- Translationale Forschung Verbindet in-vitro-Befunde mit menschlichen Krankheitsmodellen durch konsistente zelluläre Phänotypen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein standardisiertes Isolationsprotokoll, das in mehreren Immunologie- und Entzündungsforschungsprogrammen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem biologisches Rauschen durch nicht-monocyten Zellen reduziert wird.
- Operationaler Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare Monozytenpräparationen und minimiert so die Variabilität zwischen Experimenten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem bereits früh im Entdeckungsprozess aussagekräftigere mechanistische Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Reaktionen menschlicher Monozyten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der aseptischen Zellhandhabung und magnetischen Trenntechniken.
- Abhängig vom Zugang zu immunmagnetischen Trennkit und magnetischen Probengefäßhaltern.
- Erfordert die Standardisierung des Zeitpunkts der Blutentnahme sowie der Antikoagulanzienanwendung an allen Standorten.
- Die Anpassung an kryokonservierte oder von erkrankten Spendern stammende Proben kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Ausbeute und Reinheit von Monozyten kann je nach Gesundheitszustand des Spenders und Verzögerungen bei der Probenaufbereitung variieren.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026