Differenzierung von human-induzierten pluripotenten Stammzellen in Makrophagen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 4:56 Min. • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adulte somatische Zellen können genetisch umprogrammiert werden, um induzierte pluripotente Stammzellen, iPSCs, zu erhalten, die stammzellähnliche undifferenzierte und proliferative Zustände aufweisen.

Um humane iPSCs in Makrophagen zu differenzieren – weiße Blutkörperchen, die Krankheitserreger und Zelltrümmer phagozytieren – beginnen Sie mit einer Kulturplatte mit einer nicht zellgebundenen Klebefläche.

Fügen Sie Medien hinzu, die die Wachstumsfaktoren Knochenmorphogenetisches Protein, Stammzellfaktor und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor enthalten. Aussaat der iPSCs und Inkubation.

Die nicht klebende Oberfläche verhindert die Anheftung von iPSCs und hält die Zellen in Suspension, was die Aggregation zu dreidimensionalen Embryoidkörpern (EBs) erleichtert. Die Wachstumsfaktoren initiieren die iPSC-Differenzierung innerhalb der EBs in mesodermale Linienzellen.

Übertragen Sie die differenzierten EBs in ein Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie sie sich durch die Schwerkraft absetzen. Resuspendieren Sie die EBs in frischen Medien, die Interleukin-3, IL3 und den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor CSF1 enthalten. Plattieren Sie die EBs auf einer mit Gelatine beschichteten Zellkulturplatte.

Gelatine – ein Protein der extrazellulären Matrix – erleichtert die EB-Bindung. IL3 regt die EBs an, sich in hämatopoetische Stamm-Vorläuferzellen zu differenzieren, wodurch myeloische Zellen entstehen. CSF1 unterstützt die Proliferation myeloischer Zellen und deren Differenzierung in Makrophagen-Vorläufer, die freigesetzt werden und in den Medien in Suspension bleiben.

Sammeln Sie die Suspensionszellen und die Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in CSF1-supplementierten Medien.

Plattieren Sie die Zellen auf unbeschichteten Kulturplatten.

CSF1 induziert die terminale Differenzierung der Makrophagen-Vorläufer in voll funktionsfähige, adhärente reife Makrophagen.

Um den Differenzierungsprozess am Tag Null zu beginnen, geben Sie 2,25 Milliliter Medium der Stufe 1 in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem geringer Befestigung. Ersetzen Sie dann bei 180 % konfluenten Vertiefungen von iPS-Zellen in einer 6-Well-Platte das Erhaltungsmedium durch 1,5 Milliliter Medium der Stufe 1. Schneiden Sie Kolonien mit einem neuen Zellpassage-Tool. Übertragen Sie die geschnittenen Kolonien mit einer Pipette in die beiden Vertiefungen der 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz.

Passen Sie an Tag 2 die Zytokinkonzentrationen an, indem Sie 0,5 Milliliter hESC-SFM-Medium in die 6-Well-Well-Platte mit den Embryoidkörpern vom zweiten Tag geben.

Beschichten Sie an Tag 4 vier Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit 0,1 % Gelatine. Entfernen Sie nach einer Inkubation von mindestens 10 Minuten die Gelatine und fügen Sie 2,5 Milliliter Medium der Stufe 2 hinzu.

Sammeln Sie gebildete Embryoidkörper aus den beiden Vertiefungen einer 6-Well-Platte und legen Sie sie in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie sie sich durch die Schwerkraft am Boden des Rohrs absetzen. Saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus dem Röhrchen ab und resuspendieren Sie die Embryoidkörper in 2 Millilitern des Stadiums 2.

10 bis 15 Embryoidkörper werden in eine mit Gelatine beschichtete Vertiefung mit 2,5 Millilitern Medium der Stufe 2 überführt und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Wechseln Sie das Medium zwei bis drei Wochen lang alle drei bis vier Tage.

Die Beschichtung der EBs ist entscheidend. Weniger als 10 oder mehr als 15 EBs oder deren ungleichmäßige Verteilung kann zu geringen Ausbeuten an Makrophagen führen.

Nach zwei bis drei Wochen beginnen die Embryoidkörper, nicht-adhärente hämatopoetische Zellen in Suspension freizusetzen. Sammeln Sie diese Zellen mit einem 40-Mikrometer-Sieb in einem 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie dann das Medium wieder auf. Die Suspension der hämatopoetischen Zellen wird drei Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.

Resuspendieren Sie die hämatopoetischen Zellen in Medien der Stufe 3. Plattieren Sie dann die Zellen mit einer Dichte von 0,2 x 106 pro Milliliter. Wechseln Sie das Medium der Stufe 3 alle fünf Tage.

Nach neun bis 11 Tagen sind die Makrophagen voll differenziert und voll funktionsfähig.

06:21

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

05:38

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

11:19

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

04:05

Differenzierung und Polarisation von Monozyten-abgeleiteten Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

04:03

Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen in Mikroglia-ähnliche Zellen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

07:42

Ein In-vitro- Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

09:32

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

06:46

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

08:05

Produktion und Charakterisierung menschlicher Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

09:03

Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellzellen des Gehirns mit einem reifen Immunphänotyp

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026