Isolierung von Makrophagen aus dem Spinalganglion der Maus mittels mechanischer Dissoziation

Das Spinalganglion (DRG) ist eine Ansammlung von neuronalen Zellkörpern entlang des Rückenmarks, die sensorische Informationen vom peripheren zum zentralen Nervensystem transportieren. Die Schädigung der peripheren Nerven führt zur Akkumulation von Makrophagen in der DRG und zur Entwicklung von neuropathischen Schmerzen.

Um lebensfähige Makrophagen mit einer enzymfreien Methode zu isolieren, nehmen Sie frisch präpariertes Maus-DRG-Gewebe in einem Homogenisator, der mit eiskaltem Puffer gefüllt ist, um den zellulären Stress zu begrenzen. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Stößel mechanisch, um die Zellen freizusetzen.

Filtrieren Sie durch ein Zellsieb, um Zellklumpen zu entfernen und eine einzellige Suspension im Durchfluss zu erhalten. Das Gewebehomogenat enthält Neuronen und nicht-neuronale Zellen, zu denen Makrophagen und frei schwebendes Myelin gehören – die isolierende Hülle der Neuronen.

Geben Sie das gefilterte Homogenat in ein Röhrchen mit einem Dichtegradientenmedium und zentrifugieren Sie. Unter Zentrifugalkraft setzen sich die lebensfähigen Zellen mit höherer Auftriebsdichte am Boden des Röhrchens ab und bilden ein Pellet, während das Myelin in der Schwebe bleibt. Entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer, der Fluorophor-konjugierte Antikörper gegen Makrophagen-spezifische Zelloberflächenrezeptoren enthält. Inkubieren Sie für die erforderliche Dauer. Der Antikörper bindet an seinen Rezeptor auf den Makrophagenzellen und markiert so fluoreszierend die Zelloberfläche. Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. Ein antikörperspezifisches Fluoreszenzsignal zeigt das Vorhandensein von Makrophagen in der Probe an.

Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums vor, indem Sie neun Volumen des Mediums mit einem Volumen calcium- und magnesiumfreiem 10X HBSS mischen und auf Eis halten. Vergewissern Sie sich, dass die Maus durch die fehlende Reaktion auf das Kneifen der Hinterpfote vollständig betäubt ist.

Beginnen Sie damit, eine betäubte Maus in Rückenlage in einen chemischen Abzug zu legen, wobei vier Pfoten mit Klebeband gesichert sind. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette unterhalb des Brustkorbs an und machen Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt, um Leber und Zwerchfell freizulegen. Schneiden Sie mit der gleichen Schere das Zwerchfell und den Brustkorb auf und öffnen Sie dann die Pleurahöhle, um das schlagende Herz freizulegen.

Schneiden Sie anschließend mit einer Irisschere schnell das rechte Vorhofohr ab. Sobald die Blutung festgestellt wird, führen Sie eine 30-Gauge-Nadel in das hintere Ende des linken Ventrikels ein und injizieren Sie langsam 10 Milliliter vorgekühltes 1X PBS, um das Tier zu perfundieren.

Um eine dorsale Laminektomie durchzuführen, platzieren Sie die Maus in Bauchlage. Verwenden Sie ein Skalpell der Größe 11, um zwei tiefe Längsschnitte zu machen, beginnend mit dem Brustbereich bis hinunter zum Sakralbereich. Entfernen Sie dann die Haut, die die dorsale Muskelschicht freilegt. Dann mit dem Friedman-Pearson Rongeur das Bindegewebe und die Muskeln abziehen, bis die lumbosakralen Wirbelsäulenfortsätze und die bilateralen Querfortsätze freigelegt sind.

Verwenden Sie zunächst einen Friedman-Pearson Rongeur, um die dorsale Wirbelsäule vorsichtig zu öffnen. Wechseln Sie dann zwischen einer Friedman-Pearson Rongeur und einer Noyes Federschere, um die Wirbelknochen zu entfernen und das Rückenmark mit intakten Spinalnerven freizulegen. Ipsilaterale und kontralaterale lumbale DRG sorgfältig präparieren.

Geben Sie es in 1 Milliliter eiskaltes calcium- und magnesiumfreies 1X HBSS in einen Dounce Gewebehomogenisator. Homogenisieren Sie das DRG-Gewebe im Dounce Homogenisator mit einem losen Stößel 20 bis 25 Mal. Legen Sie ein steriles 70-Mikrometer-Zellsieb aus Nylon in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie 800 Mikroliter eiskaltes 1X HBSS, um das Zellsieb zu befeuchten.

Verwenden Sie eine Pipette, um die homogenisierte Gewebesuspension aus dem Homogenisator auf das Nasszellensieb zu sammeln und in das konische 50-Milliliter-Röhrchen zu füllen. Spülen Sie den Homogenisator zweimal mit 800 Mikrolitern eiskaltem 1X HBSS und sammeln Sie die Flüssigkeit in demselben konischen 50-Milliliter-Röhrchen, um die Ausbeute zu erhöhen.

Geben Sie 1,5 Milliliter äquilibriertes eiskaltes isotonisches Dichtegradientenmedium in ein steriles 5-Milliliter-Polystyrol-FACS-Röhrchen. Übertragen Sie das Zellhomogenat aus dem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in dieses FACS-Röhrchen und pipettieren Sie es nach oben und unten, um es gut zu mischen.

Fügen Sie weitere 500 Mikroliter 1X HBSS hinzu, um die Oberseite zu versiegeln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 mal g für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Den myelinhaltigen Überstand im Medium vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet am Boden des Röhrchens zu stören.

Geben Sie 100 Mikroliter PBS mit 5 % fötalem Rinderserum zum Pellet und resuspendieren Sie die DRG-Zellen. Geben Sie dann den Alpha-Maus-Antikörper CX3CR1-APC in die Zellen und inkubieren Sie 1 Stunde lang im Dunkeln bei 4 Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 Millilitern PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 360 mal g für 8 Minuten bei 4 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in 300 Mikrolitern PBS für die FACS-Analyse.