Warum ist die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer-Plaques für die Target-Validierung wichtig?

Die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer-Plaques liefert eine gereinigte Quelle primärer B- und T-Zellen aus dem mit dem Darm assoziierten lymphatischen Gewebe und ermöglicht die funktionelle Validierung immunmodulatorischer Zielstrukturen in einem krankheitsrelevanten System. Dies unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem die Bindung an das Zielmolekül und die biologische Aktivität in physiologisch relevanten Immunzellen bestätigt werden.

Wie passt die agitation-abhängige Zellfreisetzung in die Entdeckungspipeline ein?

Der Schüttelschritt mit dem Orbitalschüttler löst Lymphozyten aus den Peyer-Plaques, wobei das Gewebe möglichst wenig beschädigt wird, und ermöglicht so die Gewinnung lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen. Dieses Ergebnis unterstützt nachgeschaltete Anwendungen wie die Durchflusszytometrie und die Zytokinscreening in frühen Entdeckungsworkflows.

Welche quantitativen Messungen ermöglichen die nachgeschaltete Analyse isolierter Lymphozyten?

Das Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Lymphozytenausbeute, der Vitalität und der Untertypenverteilung durch Zählung und Durchflusszytometrie nach Resuspension in definiertem Medium. Diese Messungen erlauben den Vergleich zwischen experimentellen Bedingungen und unterstützen die Standardisierung von Assays.

Warum sind Replikation und standardisierte Verarbeitung wichtig für die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Fachbereichen?

Standardisierte Schritte bei der Dissektion, dem Schütteln und der Filtration gewährleisten eine reproduzierbare Isolierung von Lymphozyten über verschiedene Experimente hinweg und verringern die Variabilität zwischen Laboren und Arbeitsgruppen. Diese Konsistenz unterstützt einen zuverlässigen Datenaustausch und Vergleich in multidisziplinären Immunologieprojekten.

Welche analytischen Voraussetzungen müssen erfüllt sein, bevor dieses Protokoll zur Isolierung von Lymphozyten angewendet wird?

Die Durchführung erfordert Zugang zu Zellzählgeräten, Durchflusszytometrie oder ähnlichen Plattformen für die phänotypische Analyse sowie Zentrifugen, die in der Lage sind, bei niedrigen Temperaturen zu arbeiten. Diese Voraussetzungen gewährleisten eine korrekte Quantifizierung, die Beurteilung der Vitalität sowie die funktionelle Analyse der isolierten Lymphozyten in nachfolgenden Schritten.

Isolierung von Lymphozyten aus einem Peyer-Pflaster der Maus

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 6:02 Min. • July 8th, 2025

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Peyer-Pflaster, PPs, Aggregate aus organisiertem lymphatischem Gewebe in der Dünndarmwand, enthalten Immunzellen wie B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, dendritische Zellen und Makrophagen.

Um Lymphozyten aus Maus-PPs zu isolieren, beginnen Sie mit einer euthanasierten Maus. Schnitte die Bauchdecke ein und lege die Bauchhöhle frei. Lokalisiere den Blindfuß. Präpariere den ileozökalen Übergang, um den Blinddarm vom Dünndarm zu trennen.

Exzidieren Sie das Mesenterium und schneiden Sie den Dünndarm am Zwölffingerdarm ein, um den Dünndarm aus der Bauchhöhle zu entfernen. Legen Sie den Dünndarm in eine Multi-Well-Platte mit gekühltem Medium und spülen Sie ihn aus, um Ablagerungen zu entfernen.

Positionieren Sie den Dünndarm mit der mesenterialen Seite nach unten und befeuchten Sie ihn mit Medium, um die Hydratation des Gewebes aufrechtzuerhalten. Identifizieren Sie die PPs – weiße, mehrlappige Aggregate auf der anti-mesenterialen Seite der Darmwand.

Schneiden Sie die PP vorsichtig heraus, ohne das umgebende Darmgewebe. In ein Röhrchen mit Medium umfüllen. Unter ständigem Rühren inkubieren. Dieser Agitationsschritt löst den Schleim, die Zelltrümmer und alle Fäkalien von den PPs und verbessert so die Rückgewinnung der PP-Lymphozyten.

Als nächstes überführen Sie das Gewebe in ein Zellsieb mit einer geeigneten Maschenweite. Lösen Sie die PPs vorsichtig auf und setzen Sie die Zellen frei. Mit Medium durch das Sieb spülen, um eine einzellige Lymphozytensuspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Suspension bei niedriger Temperatur, um die Stabilität der Zelle zu erhalten.

Resuspendieren Sie die Lymphozyten in Medium und verwenden Sie sie für die weitere Analyse.

Beginnen Sie damit, eine Maus in Rückenlage zu bringen und den Bauch mit 70% Ethanol zu sterilisieren. Machen Sie einen Bauchschnitt in der Mittellinie durch die Haut und das Bauchfell vom Schambein bis zum Brustkorb, um die Bauchhöhle zu öffnen und den Blinddarm und den Ileozökalübergang zu lokalisieren.

Machen Sie einen möglichst distalen Schnitt an der Verbindungsstelle, um den Dünndarm vom Blinddarm zu trennen, und schneiden Sie das Mesenterium mit einer Schere, um den gesamten Dünndarm vorsichtig bis zum Schließmuskel des Pylorus zu entfernen.

Schneiden Sie die Verbindung zwischen dem Pylorus und dem Zwölffingerdarm ab, um den Dünndarm vollständig von der Bauchhöhle zu lösen, und legen Sie den isolierten Dünndarm in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit kaltem RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum oder FBS auf Eis. Bewegen Sie dann das Gewebe vorsichtig manuell, bis alle Segmente in das kalte Medium eingetaucht sind.

Wenn alle Därme entnommen wurden, fassen Sie mit einer Pinzette das mesenteriale Fett an einem Rand des Darms und legen Sie die Probe mit der mesenterialen Seite nach unten auf ein Papiertuch. Befeuchten Sie das gesamte Darmsegment mit RPMI plus 10 % FBS, um Austrocknung und Klebrigkeit des Gewebes zu vermeiden, und lokalisieren Sie die Peyer-Flecken, die als weiße, mehrlapulierte Aggregate mit einer blumenkohlähnlichen Form auf der antimesenterialen Seite der Darmwand erscheinen.

Um die Peyer-Pflaster zu ernten, verwenden Sie eine gebogene chirurgische Schere mit der Kurve nach oben, um jedes Pflaster vorsichtig von seinen distalen und proximalen Rändern zu entfernen, wobei Sie darauf achten, das umgebende Darmgewebe auszuschließen, und legen Sie die Peyer-Pflaster während der Entnahme in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die eiskaltes RPMI plus 10 % FBS enthält.

Wenn alle Pflaster erfasst wurden, schneiden Sie mit einer Schere die Spitze einer 1-Milliliter-Mikropipettenspitze so ab, dass der Durchmesser groß genug ist, um einzelne Peyer-Pflaster zu aspirieren, und übertragen Sie die Peyer-Pflaster in ein konisches 150-Milliliter-Röhrchen pro Maus, das 25 Milliliter 37 Grad Celsius RPMI plus 10 % FBS enthält.

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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026

Isolierung von Lymphozyten aus einem Peyer-Pflaster der Maus

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