Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus menschlichen Buffy Coats

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, PBMCs, bestehen aus einer heterogenen Population spezialisierter Immunzellen, darunter Lymphozyten, Monozyten und dendritische Zellen.

Um PBMCs zu isolieren, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit einem frisch gewonnenen menschlichen Buffy-Coat-Blut. Das Blut der Buffy-Hülle enthält PBMCs sowie Granulozyten mit mehrlappigen Zellkernen, Erythrozyten und Blutplättchen, die im Plasma suspendiert sind.

Überlagern Sie die Buffy-Coat-Suspension vorsichtig über ein gleiches Volumen eines Dichtegradienten-Mediums mit einer gewünschten spezifischen Dichte, die für die PBMC-Trennung optimal ist.

Während der Zentrifugation trennen sich die verschiedenen Zelltypen in unterschiedliche Schichten, basierend auf den Zelldichten relativ zum Gradientenmedium. Darüber hinaus fördern die Polysaccharide im Dichtegradientenmedium die Erythrozytenaggregation und -sedimentation.

Die Erythrozyten und Granulozyten mit höherer Dichte sedimentieren zum Boden des Röhrchens, während das Plasma mit der geringsten Dichte die oberste Schicht bildet. Die PBMCs, die eine geringere Dichte als das Dichtegradientenmedium aufweisen, bilden eine wolkige weiße Schicht an der Schnittstelle zwischen Plasma-Dichtegradienten-Medium.

Entfernen Sie die oberste Plasmaschicht. Sammeln Sie vorsichtig die trübe Schicht, die die PBMCs enthält, und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen mit serumfreiem Medium. Die PBMCs werden durch Zentrifuge granuliert. Der Überstand mit den Blutplättchen und das restliche Gradientenmedium werden verworfen.

Die PBMCs werden in frischem Medium resuspendiert und zur weiteren Analyse verwendet.

Um PBMC aus menschlichen Spender-Buffy-Coats zu isolieren, überlagern Sie mit einer Pipette langsam 15 Millimeter Buffy-Coat-Blut an der Seite eines 50-Milliliter-Röhrchens auf 15 Milliliter Dichtegradientenmedium und trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Verwenden Sie eine sterile Pasteur-Pipette, um die oberste Plasmaschicht zu entfernen, und übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie serumfreies RPMI-Medium bis zu einem Endvolumen von 50 Millilitern in die Zellen und drehen Sie das Röhrchen vor dem Zentrifugieren einige Male vorsichtig um. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 20 Millilitern serumfreiem Medium zur Zählung.