Erzeugung unreifer, reifer und tolerogener dendritischer Zellen aus Monozyten

Um eine Immunantwort hervorzurufen, präsentieren dendritische Zellen, DCs, ein Antigen, das mit MHC Klasse-II und den co-stimulatorischen Molekülen CD80 und CD86 angezeigt wird. Basierend auf den Merkmalen der Immunantwort werden sie in unreife, reife und tolerogene DCs unterteilt.

Um verschiedene dendritische Zelluntergruppen in vitro zu erzeugen, beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit humanen Monozyten – Immunvorläuferzellen in einem vollständigen Medium, das Wachstumsfaktoren und das Zytokin IL-4 – ein Signalmolekül – enthält.

Inkubieren Sie die Zellen für eine längere Zeit. Die Wachstumsfaktoren und IL-4 induzieren die Proliferation von Monozyten und die Differenzierung in unreife DCs.

Unreife DCs besitzen Mustererkennungsrezeptoren, PRRs, und exprimieren niedrige MHC-Klasse-II- und co-stimulatorische Moleküle, was eine verminderte Fähigkeit zeigt, eine Immunantwort hervorzurufen.

Behandeln Sie einen Brunnen, der unreife DCs enthält, mit immunmodulatorischen Wirkstoffen – Vitamin D3 und Glukokortikoiden. Diese immunmodulatorischen Wirkstoffe regulieren die Expression von MHC-Klasse-II und co-stimulatorischen Molekülen herunter. Dies führt zu einer Differenzierung in tolerogene DCs – immunregulatorische Zellen, die übertriebene oder unerwünschte Immunantworten verhindern.

Behandeln Sie eine andere Vertiefung, die unreife DCs enthält, mit Lipopolysaccharid, LPS – einem Antigen. LPS interagiert mit dem Toll-like-Rezeptor-4 der Zellen – einem PRR, initiiert eine Signalkaskade und differenziert sie zu reifen Zellen. Diese Zellen exprimieren hohe MHC-Klasse-II-Moleküle, co-stimulatorische Moleküle und PRRs – effizient für die Antigenverarbeitung und -präsentation.

Beobachten Sie die unterschiedlich behandelten Vertiefungen auf unterschiedliche morphologische Merkmale, die die dendritischen Zellsubtypen repräsentieren.

Vier Sätze CD14+-Monozyten in einer Konzentration von 0,3 bis 0,5 x^10,6 pro Milliliter IL-4-Zellkulturmedium in Sechs-Well-Platten aussäen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂. Nehmen Sie an Tag 4 850 Mikroliter Medium aus der Kultur und zentrifugieren Sie.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Zellkulturmedium. Geben Sie die Zellmischung zurück in die Kultur. Fügen Sie an Tag 5 1 Mikroliter Vitamin-D3-Brühe und 1 Mikroliter Dexamethason-Brühe pro Milliliter Medium zu zwei der Sets hinzu, um tolerogene moDCs zu erzeugen.

Fügen Sie an Tag 6 200 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF und 200 Nanogramm pro Milliliter IL-4 zu allen Sets hinzu. Geben Sie 1 Mikrogramm pro Milliliter LPS zu einem der Sets, die nur mit GM-CSF und IL-4 behandelt wurden, um reife moDC zu erzeugen.

Fügen Sie 1 Mikrogramm pro Milliliter LPS zu einem Satz der tolerogenen moDCs hinzu, um LPS-tolerogene moDCs zu erzeugen. Ernten Sie schließlich an Tag 7 die verschiedenen Arten von moDCs, indem Sie die Kulturschale mit PBS-EDTA spülen.