Isolierung und Reinigung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut

Um eine immunomagnetische negative Trennung von B-Zellen durchzuführen, sammeln Sie menschliches peripheres Blut in einem gerinnungshemmenden Röhrchen, um die Blutgerinnung zu verhindern. Fügen Sie rote Blutkörperchen, RBC und Lysepuffer hinzu, um die Erythrozyten zu lysieren, ohne andere Blutzellen zu beeinträchtigen.

Zentrifuge, um die intakten, dichteren Blutzellen aus den weniger dicht lysierten Erythrozyten, die im Überstand verbleiben, zu sedimentieren. Entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet in frischem Medium.

Übertragen Sie die Zellen auf eine Kulturplatte. Inkubieren, damit die Makrophagen und Monozyten an der Platte haften können, während die nicht adhärenten Zellen, einschließlich B-Zellen, in Suspension bleiben.

Sammeln Sie die Zellen in Suspension in einem frischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren und in einem Puffer wieder zu suspendieren.

Fügen Sie eine Cocktaillösung hinzu, die biotinylierte Antikörper enthält, die spezifisch für andere Blutzellen als B-Zellen sind. Die Antikörper binden an Antigene auf der Oberfläche von Nicht-B-Zellen, so dass die B-Zellen unmarkiert bleiben.

Zentrifuge. Der Überstand mit ungebundenen Antikörpern ist zu verwerfen.

Fügen Sie eine Lösung aus Streptavidin-konjugierten magnetischen Kügelchen hinzu. Während der Inkubation bindet das Streptavidin auf den Mikrokügelchen fest an die biotinylierten Antikörper, die an Nicht-B-Zellen gebunden sind, und bildet Komplexe.

Platzieren Sie das Röhrchen in einem Magnetfeld, um die an Magnetkügelchen gebundenen Nicht-B-Zellen an den Röhrchenwänden zu haften, wobei die B-Zellen in Suspension bleiben. Den Überstand mit den reinen B-Zellen in ein Röhrchen umfüllen.

Zentrifugieren Sie die B-Zellen und resuspendieren Sie sie in Medium für die weitere nachgelagerte Analyse.

Unmittelbar nach der Entnahme einer 10-Milliliter-Blutprobe aus der Cubitalvena medianus in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit kaliumergänztem EDTA ist das Röhrchen mehrmals umzudrehen, um die Bildung von Gerinnseln zu verhindern. Geben Sie dann 35 Milliliter autoklavierten Lysepuffer für rote Blutkörperchen in die Zellen für eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Wenn Licht durch das Röhrchen zu sehen ist, zentrifugieren Sie das Blut und bestätigen Sie das Vorhandensein eines weißen Kügelchens. Entfernen Sie den restlichen Lysepuffer mit 10 Millilitern Autoklav zu PBS und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern RPMI 1640 Medium.

Legen Sie die Zellen in eine 10-Zentimeter-Kulturschale für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Schwenken Sie dann die Kulturschale einige Male vorsichtig und geben Sie die schwimmenden Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Nach zwei Wäschen durch Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von 5 bis 10 x 10⁶ Zellen pro Milliliter in 200 Mikrolitern kaltem PBS-Puffer und fügen Sie 5 Mikroliter eines biotinylierten Anti-Human-Antikörper-Cocktails hinzu, der spezifisch für Blutzellen pro 1 x 10⁶ Zellen ist.

Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis waschen Sie die Zellen in einem 10-fach überschüssigen Volumen sterilem PBS und resuspendieren Sie das Pellet in 5 Mikrolitern Streptavidin-konjugierten Mikrokügelchen pro 1 x 10⁶ Zellen für eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Am Ende der Inkubation geben Sie 2 Milliliter PBS-Puffer in die Zellen und stellen Sie das Röhrchen 8 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Magnetständer.

Wenn sich die Mikrokügelchen an der Wand des Röhrchens festgesetzt haben, übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues konisches Röhrchen und geben Sie 2 weitere Milliliter PBS-Puffer zu den Zellen. Nach der zweiten Überstandsentnahme werden die gepoolten Zellen durch Zentrifugation gesammelt und die Zellen in ein 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen in frischem PBS-Puffer in einer Konzentration von 1 x 10⁷ Zellen pro Milliliter überführt.